袁偉權(quán) 黎藝強 陳志鵬 林瑋 趙勝利 莫小毅 陳柏齡

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科（廣州510080）；2廣東省骨科學(xué)重點實驗室（廣州510080）；3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心骨科（廣州510623）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是常見的全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨強度降低和易發(fā)生脆性骨折［1-2］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是OP 中最常見的一種。據(jù)估計，全世界超過2 億人患有OP，歐美國家大約30%的絕經(jīng)后婦女患有OP［3］。雙膦酸鹽是治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一線藥物，能特異的與骨質(zhì)中的羥膦灰石結(jié)合，抑制破骨細胞活性，從而抑制骨質(zhì)吸收［4-5］。福美加（阿侖膦酸鈉維D3）為阿侖膦酸鈉和維生素D3的復(fù)方制劑，是目前臨床上常用的抗骨質(zhì)疏松藥物，能顯著抑制骨質(zhì)流失，增加骨密度，減少髖部、椎體和非椎體骨折［6-7］。既往研究中，OP 治療的療效觀察主要集中在骨密度及骨代謝產(chǎn)物方面［8］，而在干骺端骨組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)方面的結(jié)論尚未知曉。本研究旨在探討福美加對去勢骨質(zhì)疏松大鼠長骨干骺端骨組織計量學(xué)和生物力學(xué)的影響，進一步觀察松質(zhì)骨富集區(qū)和皮質(zhì)區(qū)在骨質(zhì)疏松發(fā)病和治療過程中的變化情況對骨質(zhì)疏松的預(yù)測、預(yù)防和治療具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3月齡雌性SPF 級Sprague Dawley（SD）大鼠30 只，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級，溫度為（25 ± 1）℃，相對濕度為55%，每日照明12 h，分籠飼養(yǎng)，自由進食水和飼料。本研究經(jīng)過中山大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。福美加（2800U）由杭州默沙東制藥有限公司提供（國藥準(zhǔn)字J20140022）。

1.2 動物分組將大鼠編號，用隨機數(shù)表法將其隨機分成3組，每組10只，分別為假手術(shù)組（Sham）、去卵巢組（OVX）和福美加組（ALN）。其中OVX、ALN 組大鼠采用背部脊柱旁切口行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，Sham 組大鼠采用相同切口，保留卵巢及輸卵管等結(jié)構(gòu)功能完整，于卵巢周圍切除相同體積的脂肪組織。

1.3 動物給藥造模8 周后，ALN 組給予大鼠等效劑量7 mg/kg 的福美加，每周灌胃1 次。Sham 和OVX 組每周灌服10 mL/kg 的生理鹽水。福美加劑量的選擇根據(jù)NAIR 等［9］報道的動物與人之間藥物劑量轉(zhuǎn)換進行等效劑量換算。所有的處理持續(xù)12 周后，將所有大鼠處死獲取股骨、脛骨和腰5 椎骨。

1.4 實驗方法

1.4.1 骨密度測量獲取的股骨和腰5 椎骨，采用雙能X 線吸收測定法（DXA，GE LUNAR?Prodigy，Madison，WI，USA）測量股骨和第5腰椎的骨密度。

1.4.2 骨組織計量學(xué)檢測所有大鼠的脛骨行骨組織形態(tài)學(xué)檢查。具體方法與我們之前的研究［10］相似。將脛骨用4%多聚甲醛固定24 h，用不同濃度的乙醇（70%、95%和100%）梯度脫水24 h，浸蠟包埋。然后用SP2500 切片機（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）在脛骨干骺端制作冠狀切片，切片厚度為5 μm，Masson 三色染色試劑盒對切片進行染色。采用半自動數(shù)字化圖像分析軟件（BioQuant Osteo 2009）進行骨組織形態(tài)學(xué)分析。分析結(jié)果包括總組織體積（TV）、骨體積（BV）和骨表面積（BS）等。然后根據(jù)這些參數(shù)計算出骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.4.3 骨生物力學(xué)指標(biāo)測定骨生物力學(xué)指標(biāo)測定在材料測試系統(tǒng)（MTS 858 bionix Ⅱmachine，MTS System Inc.，Minneapolis，MN，USA）下進行。每只大鼠的股骨均被隨機分配進行股骨干彎曲試驗和股骨干骺端彎曲試驗。這兩種生物力學(xué)彎曲試驗測定方法與我們之前的研究相同［10-11］。將股骨干和干骺端（骨骺近5 mm）分別水平固定在MTS 平臺上，并向其施加5 mm/min 恒定位移的垂直力，直到股骨樣本破壞。記錄載荷和位移，根據(jù)載荷-位移曲線計算了最大載荷、破壞載荷和剛度［11］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD?t檢驗法。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度ALN 組大鼠1只在實驗結(jié)束前死亡，被排除在外。不同組別大鼠的體質(zhì)量和骨密度結(jié)果見表1。實驗前大鼠組間在體質(zhì)量上無明顯差異。實驗結(jié)束時，Sham 組大鼠體質(zhì)量明顯低于其他組（P<0.05）。ALN和OVX組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。OVX組股骨和L5椎體骨密度明顯低于ALN 組（P< 0.05）。ALN 和Sham 組股骨和L5 椎體骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 不同組別大鼠的體質(zhì)量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

表1 不同組別大鼠的體質(zhì)量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

組別實驗前體質(zhì)量實驗后體質(zhì)量股骨骨密度L5椎體骨密度OVX（n=10）238.2±37.5 361.3±22.2 0.202±0.029 0.149±0.014 Sham（n=10）251.2±30.7 310.5±37.6 0.221±0.033 0.172±0.011 ALN（n=9）236.6±33.2 365.1±18.4 0.241±0.018 0.177±0.011 P值0.748 0.001 0.006<0.001

2.2 骨組織計量學(xué)Sham 和ALN 組骨量明顯高于OVX 組（圖1A）。ALN 組骨質(zhì)量參數(shù)（BV/TV，Tb.N，Tb.Th）均明顯大于OVX 組（P< 0.05，圖1B）。在骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）上，ALN 和Sham 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖1B）。

2.3 生物力學(xué)股骨干彎曲試驗和股骨干骺端彎曲試驗結(jié)果見表2。Sham 和ALN 組股骨干及干骺端的最大載荷、破壞載荷和剛度明顯高于OVX 組（P< 0.05）。Sham 和ALN 組之間股骨干生物力學(xué)參數(shù)無明顯差異（P> 0.05）。OVX 組與ALN 組股骨干骺端彎曲試驗最大載荷、破壞載荷的均值顯著高于股骨干彎曲試驗（P< 0.05，圖2）。

表2 不同組別兩種生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

表2 不同組別兩種生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

組別骨干彎曲試驗最大載荷（N）破壞載荷（N）剛度（N/mm）干骺端彎曲試驗最大載荷（N）破壞載荷（N）剛度（N/mm）OVX（n=10）101.01±12.60 85.08±8.17 106.62±14.77 60.24±2.82 41.57±5.33 66.70±8.20 Sham（n=10）119.56±15.56*106.44±13.73*147.83±14.60*108.07±15.29*91.94±10.31*110.21±13.25*ALN（n=9）127.98±14.62*110.14±13.68*143.30±14.26*106.63±14.40*92.13±13.23*100.92±12.11*

3 討論

圖2 兩種股骨彎曲試驗ALN?OVX 平均差值的比較Fig.2 Comparison of mean difference ALN?OVX in two femur bending tests

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的類型［2］。3月齡雌性大鼠的性器官已經(jīng)成熟、體重已趨于穩(wěn)定，體內(nèi)骨的形成和吸收處于平穩(wěn)狀態(tài)［12］，能很好地模擬絕經(jīng)后的OP。在本研究中，我們采用卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察到OVX 組大鼠骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)較Sham 組明顯減少，而經(jīng)過福美加治療后大鼠骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)明顯增多并與Sham 組無明顯差異，而在皮質(zhì)區(qū)上則未見明顯差異。這可能是由于在雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP 模型中，干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)骨量的丟失早于皮質(zhì)區(qū)［13］，而福美加的運用，能逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏誘導(dǎo)的松質(zhì)骨富集區(qū)骨量丟失。既往有研究表明卵巢切除大鼠股骨骨干未見BMD、骨幾何學(xué)或機械強度的改變，可能是因為皮質(zhì)骨比松質(zhì)骨更不易受卵巢切除影響而引起骨丟失［14］。而在JU 等［13］的研究中發(fā)現(xiàn)，卵巢切除大鼠模型中松質(zhì)骨富集區(qū)小梁骨的厚度、數(shù)目和連接減少。破骨細胞和成骨細胞的活動失衡是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要原因［15］。阿侖膦酸鹽與骨骼羥磷灰石的親和力高，能特異性地結(jié)合到骨表面抑制破骨細胞的功能，抑制松質(zhì)骨富集區(qū)骨的吸收來減少骨重塑，而在皮質(zhì)骨組織中則未見明顯改變［16-17］。福美加能逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏誘導(dǎo)的松質(zhì)骨富集區(qū)骨量的丟失，這可能與鈣磷代謝密切相關(guān)［18］。有研究表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女運用福美加一段時間后能明顯改善血清和尿中鈣磷及相關(guān)代謝物的含量［19］、減少骨量丟失和提高腰椎BMD［18］。SAKKA 等［8］在治療Hajdu?Cheney 綜合征時發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸鹽的運用可提高患者腰椎BMD 和縱向皮質(zhì)厚度和密度。研究發(fā)現(xiàn)，類固醇可通過增強皮質(zhì)骨的形成進而增加大鼠長骨的尺寸、骨密度和強度，而雌激素則可通過抑制骨吸收來維持松質(zhì)骨富集區(qū)骨小梁的骨密度［20］。MOSEKILDE 等［16］觀察單側(cè)后肢固定大鼠模型4 周后發(fā)現(xiàn)松質(zhì)骨富集區(qū)骨強度顯著下降約16%～28%，而骨干中央?yún)^(qū)皮質(zhì)骨未觀察到明顯的變化。TOLEDANO 等［21］提出骨小梁質(zhì)量的測定可以衡量骨質(zhì)疏松的程度?？傮w而言，筆者認為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨量的丟失是從松質(zhì)骨富集區(qū)小梁骨丟失開始，逐漸發(fā)展到皮質(zhì)骨骨量的丟失，而福美加等藥物的運用早期即可通過抑制松質(zhì)骨富集區(qū)骨的吸收來增強骨的強度、提高患者的骨質(zhì)量和骨密度。因此，骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)骨量情況可作為骨質(zhì)疏松早期診斷和藥物治療的監(jiān)測部位，將對骨質(zhì)疏松的早期診斷和治療監(jiān)測發(fā)揮重要的作用。

雌激素缺乏可使干骺端骨小梁體積減少，增加遠端干骺端和骨干中央?yún)^(qū)皮質(zhì)骨的體積［22］。THORMANN 等［23］在研究骨質(zhì)疏松與生理性骨骺端骨折愈合中發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松性骨和非骨質(zhì)疏松性骨的干骺端骨缺損愈合存在差異。目前，動物股骨生物力學(xué)實驗常用檢測方式為股骨干彎曲試驗，即三點彎曲試驗［8，24］。股骨干彎曲試驗在診斷骨質(zhì)疏松和早期治療療效觀察中存在靈敏度較差、差異性較大的情況［11］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松早期和骨質(zhì)疏松治療早期，骨量的丟失和生成主要集中在松質(zhì)骨富集區(qū)［25-26］，而股骨干骺端彎曲試驗可反映干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)骨強度的情況。我們既往的研究表明股骨干骺端彎曲試驗可用于評估骨質(zhì)疏松大鼠的股骨生物力學(xué)特性變化，且具有靈敏度較高，穩(wěn)定性較好的特征［11］。本研究進行了兩項生物力學(xué)試驗的比較，發(fā)現(xiàn)股骨干骺端彎曲試驗最大載荷和破壞載荷中，OVX 組與治療組的差值差異顯著高于股骨干彎曲試驗。表明股骨干骺端彎曲試驗可用于評估骨質(zhì)疏松的診斷和治療療效觀察，并且股骨干骺端彎曲試驗在評估骨質(zhì)疏松大鼠的生物力學(xué)性能變化方面比股骨干彎曲試驗更敏感。

綜上所述，雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，松質(zhì)骨富集區(qū)骨量丟失較皮質(zhì)區(qū)明顯。福美加的運用可顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、骨組織計量學(xué)參數(shù)和生物力學(xué)性能，且作用于長骨干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)的效果大于皮質(zhì)區(qū)。在今后的研究中，我們將進一步探討抗骨質(zhì)疏松藥物預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松的具體機制和分子機制，與臨床相結(jié)合，為骨質(zhì)疏松的早期預(yù)測、預(yù)防和治療提供新的證據(jù)。