雷汝清, 牛宇敏, 郭巧珍, 邵 兵, 丁曉靜*

(1. 首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院, 北京 100069; 2. 北京市疾病預防控制中心, 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室, 北京 100013; 3. 北京市預防醫(yī)學研究中心, 北京 100013)

我國生產和使用的三唑類農藥達20多種[1,2],作為一種高效、低毒和廣譜的內吸性殺菌劑,三唑類農藥被廣泛用于多種病害防治[3],是目前銷量最大且最有發(fā)展前景的一類殺菌劑。然而在農作物種植、加工、貯存等過程中過量或不當施用,已造成這類物質殘留在農作物和環(huán)境中[4],并通過食物鏈,在動物組織中富集和累積[5],可能擾亂人體內分泌,具有致突變作用[6]。其中烯效唑、己唑醇、戊唑醇、丙環(huán)唑和氟環(huán)唑被美國環(huán)保署列為可能的人類致癌物[7,8]。我國食品安全標準[9]中僅規(guī)定了部分三唑類殺菌劑在食品中的限量標準,與美國[10]、歐盟[11]等地法規(guī)存在差異,表1為我國、美國和歐盟對西紅柿中三唑殺菌劑的限量標準。此外,隨著全球殺菌劑需求的增長,新型三唑類殺菌劑的研發(fā)和應用具有廣闊前景,但其健康風險仍需評價。為應對國際貿易法規(guī)差異以及新型化合物發(fā)現(xiàn)和預警需求,有必要建立食品中三唑類殺菌劑的非靶向快速篩查方法。

目前,文獻報道的土壤、水體、植物性樣品及肉類樣品中一種或幾種三唑類殺菌劑的測定均為靶向測定[5,12-15],無法對法規(guī)差異或者新型三唑類殺菌劑進行快速非靶向篩查?；谔卣魉槠蛱卣髦行詠G失的高分辨質譜已被用于食品中有機磷類和唑類農藥[16]及合成阿片類藥物[17]等的篩查[18]。文獻[16]根據精確質荷比為 70.039 97 的共性特征離子來判斷三唑類農藥。本研究在此基礎上,加入共同中性丟失以及更多樣的共同特征碎片離子,能夠更精確地篩查三唑類殺菌劑。孫東明[19]結合量子化學計算對三唑類殺菌劑的質譜解離機理進行研究,將14種三唑類殺菌劑按主鏈結構的不同分成6類并分析其質譜解離機理。本文依據GB 2763-2019[9]選取19種三唑類殺菌劑為研究對象,根據主鏈結構差異將三唑類殺菌劑分為8類。選取每一類中1種代表性化合物,分析質譜裂解途徑并總結裂解規(guī)律,用其余的11種三唑類殺菌劑標準品對裂解規(guī)律進行驗證,其中三環(huán)唑和腈菌唑的裂解途徑與文獻[19]進行了對比,并解析了文獻[19]未解析的6種三唑類殺菌劑的質譜裂解途徑。將此裂解規(guī)律應用于西紅柿中該類物質的非靶向篩查,為三唑類殺菌劑殘留的快速篩查提供參考。

表 1 中國、美國和歐盟對西紅柿中三唑類殺菌劑殘留的限量Table 1 Limits of triazole fungicide residues in tomatoes in China, the United States and the European Union

-: no clear limits of triazole fungicides in tomatoes.

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC I-Class,美國Waters公司);離子淌度四極桿飛行時間質譜儀(Vion IMS Q-TOF,美國Waters公司);超純水器(Milli-Elix/RiOs,美國Millipore公司)。

19種三唑類殺菌劑標準品:三環(huán)唑、唑嘧菌胺、氟硅唑、戊菌唑、三唑酮、烯唑醇、烯效唑、多效唑、戊唑醇、粉唑醇、四氟醚唑、腈菌唑、氟環(huán)唑、糠菌唑、苯醚甲環(huán)唑均購自美國AccuStandard公司(100 mg/L);亞胺唑購自美國AccuStandard公司(50 mg/L);腈苯唑、丙環(huán)唑購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;環(huán)丙唑醇購自美國Sigma-Aldrich公司,純度均大于97% 。質譜純乙腈購自美國Honeywell公司;甲酸(分析純)購自北京J&K公司。QuEChERS試劑管(2 mL,含PSA 50 mg, C1850 mg,無水硫酸鎂150 mg,購自中國Dikma公司)。16份西紅柿樣品購于北京某超市。

1.2 標準溶液配制

19種三唑類殺菌劑標準儲備液:分別準確稱取丙環(huán)唑、腈苯唑、環(huán)丙唑醇這3種標準品各10.0 mg,用乙腈溶解并稀釋定容至10 mL,配制成 1 000 mg/L 的儲備液,其余16種化合物均以購買的原液作為儲備液,于-20 ℃保存,備用。

標準工作溶液:使用時將各單標分別用10%(v/v)乙腈水溶液稀釋,配制成10 mg/L 標準溶液,于4 ℃保存,備用。11種化合物的混合標準溶液中粉唑醇、氟環(huán)唑、三唑酮、四氟醚唑、丙環(huán)唑、腈苯唑、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、烯效唑、烯唑醇、多效唑的質量濃度均為1 mg/L。

1.3 色譜和質譜檢測條件

色譜條件:色譜柱為Acquity UPLCTMBEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司);柱溫:50 ℃;樣品室溫度:4 ℃;進樣體積5 μL。流動相A相為0.1% (v/v)甲酸水;流動相B相為0.1% (v/v)甲酸乙腈;流速為0.45 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 2%B; 0.5～5.9 min, 2%B～99%B; 5.9～6.1 min, 99%B; 6.1～6.3 min, 99%B～2%B; 6.3～7.0 min, 2%B。

質譜條件:電噴霧電離源(ESI),正離子模式;毛細管電壓:1.00 kV;錐孔電壓:40 V;離子源溫度:120 ℃;碰撞氣:氮氣;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞能:低能6 eV,高能15～60 eV;掃描范圍:50～1 000 Da;掃描方式:采用MSE模式采集數(shù)據。為保證質量數(shù)精度,以亮氨酸腦啡肽(Leu-enkephalin, 0.25 mg/L,m/z556.276 6)進行實時質量校準。

1.4 樣品前處理

參照文獻[9]方法處理樣品:將西紅柿樣品可食部分切碎,混勻封閉,避光備用。

準確稱取1.00 g(±0.05 g)處理好的西紅柿樣品于15 mL離心管中,加入2 mL乙腈,渦旋1 min,超聲提取10 min, 9 000 r/min 離心10 min。取1.0 mL上清液加入QuEChERS試劑管中,渦旋1 min, 14 000 r/min 離心5 min。吸取上清液過0.22 μm濾膜,供UPLC-Q-TOF MS進樣分析。

1.5 篩查方法

采用UNIFI軟件對原始數(shù)據進行處理,通過MSE掃描模式,獲得化合物的精確相對分子質量和二級質譜數(shù)據,解析裂解規(guī)律。UNIFI軟件中有一功能為利用共同碎片離子和共同中性丟失篩查可疑化合物的應用模塊,將分析出的裂解規(guī)律應用于該模塊,可實現(xiàn)對實際樣品中采集到的數(shù)據進行三唑類殺菌劑殘留篩查分析。檢索參數(shù)為:共同離子碎片精確質量偏差為±2.0 mDa;共同中性丟失精確質量偏差±4.0 mDa。設置檢索條件:1.共同碎片模式:a.候選化合物中含有設置的共同碎片離子(三環(huán)唑:m/z163.032 4、m/z136.021 5;唑嘧菌胺:m/z249.207 4、m/z176.093 1、m/z149.082 2;三唑環(huán)作為取代基:m/z70.034 0;含取代苯結構:一元鹵素取代m/z125.015 3、m/z89.038 6,二元鹵素取代m/z122.999 6、m/z89.038 6); b.候選化合物中檢測到共同中性丟失(C2H3N3、C2H2、C2H4、C3H4、C3H6、C4H10、C4H6、C4H8、C6H5Cl、CH4、C7H16、 CO、HBr、HCHO、HCl、HCN、HF)。候選化合物需同時滿足1a、1b兩個條件。2.對比模式:a.滿足條件1的候選化合物僅在樣品中檢索到而空白樣品中未檢索到;b.滿足條件1的候選化合物在樣品與空白樣品中均有檢出時,該物質在樣品中的響應需比在空白樣品中的響應高出至少10倍。實際樣品檢測時,候選化合物滿足2a或2b其一即可。同時滿足條件1、2的化合物為可疑候選化合物。

圖 1 19種三唑類殺菌劑的化學結構Fig. 1 Chemical structures of the 19 compoundsGroups: 1st group, No. 1; 2nd group, No. 2; 3rd group, No. 3; 4th group, No. 4; 5th group, No. 5; 6th group, Nos. 6-13; 7th group, Nos. 14-15; 8th group, Nos.16-19.

2 結果與討論

2.1 三唑類殺菌劑的質譜裂解途徑

圖1為19種三唑類殺菌劑的化學結構式。從結構式可以看出,三唑類殺菌劑都具有1,2,4-三唑官能團和取代苯基等共同特點,1,2,4-三唑官能團中的N原子易于接受質子,因此在正離子模式下檢測響應較高,易于形成[M+H]+的準分子離子峰[20],但由于結構上仍然存在較大的差異,導致其質譜裂解途徑存在較大差異。因此根據其結構特點,將三唑類殺菌劑分為8類(見圖1),每類選擇1種典型化合物進行裂解途徑研究。8種選定的典型三唑類殺菌劑的質譜信息見表2,二級質譜圖見圖2,可能的裂解途徑見圖3。

第一類:三環(huán)唑。三環(huán)唑的結構與其他三唑類殺菌劑顯著不同,其中的1,2,4-三唑官能團與苯并噻唑共用兩個原子,形成穩(wěn)定的共軛體系。其二級質譜圖顯示:準分子離子[M+H]+為m/z190.043 1,主要二級碎片為m/z163.032 2、m/z136.021 4。三環(huán)唑可能的裂解途徑見圖3[19]。其中準分子離子r0m/z190.043 1(理論m/z190.043 3)首先斷裂C-N鍵得到r1,異構化后得到r2,脫去一分子HCN得到m/z163.032 2(理論m/z163.032 4)的r3。r3經S-N鍵斷裂后得到r4,繼而進一步脫去HCN得到m/z136.021 4(理論m/z136.021 5)的r5。

表 2 8種三唑類殺菌劑的高分辨質譜數(shù)據Table 2 High resolution mass spectrometry data of eight triazole fungicides

圖 2 8種三唑類殺菌劑的二級碎片質譜圖Fig. 2 Secondary fragment ion spectra of the eight triazole fungicides

第二類:唑嘧菌胺。唑嘧菌胺的1,2,4-三唑官能團與嘧啶共用兩個原子,由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:準分子離子r0m/z276.218 2(理論m/z276.218 3)丟失一分子庚烷得到m/z176.092 8(理論m/z176.093 1)的r1, r0也可經過結構重排后丟失中性分子HCN得到m/z249.208 2(理論m/z249.207 4)的r2,繼而丟失一分子庚烷得到m/z149.081 3(理論m/z149.082 2)的r3。

第三類:亞胺唑。亞胺唑結構中含碳-氮雙鍵,且分子中含有硫,其結構與其他三唑類殺菌劑不同,因此將其單獨討論。由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:其中準分子離子r0m/z410.999 7(理論m/z410.999 9)通過丟失1,2,4-三唑中性分子得到m/z341.966 9(理論m/z341.967 2)的r1,繼而丟失一分子氯苯得到m/z229.959 1(理論m/z229.959 3)的r2。r1亦可直接丟失C8H5Cl2NS得到m/z125.015 0(理論m/z125.015 3)的r3,繼而丟失一分子HCl得到m/z89.038 4(理論m/z89.038 6)的r4。

第四類:氟硅唑。氟硅唑結構中含有硅烷,屬于有機硅,與其他三唑類殺菌劑結構有較大區(qū)別,因此單獨討論其裂解途徑。由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:準分子離子r0m/z316.107 2(理論m/z316.107 6)首先脫去1,2,4-三唑中性分子得到m/z247.074 4(理論m/z247.074 9)的r1, r1可脫去一分子HF得到m/z227.068 2(理論m/z 227.068 7)的r2。r0可去甲基得到m/z300.076 7(理論m/z300.076 3)的r3,繼而脫去一分子C3H3N3得到m/z219.043 1(理論m/z219.043 6)的r4, r4脫去一分子C6H5F得到m/z123.005 8(理論m/z123.006 1)的r5。

第五類:戊菌唑。戊菌唑與其他三唑類殺菌劑相比,結構較為特殊,除典型的1,2,4-三唑官能團和鹵代苯外無其他取代基,裂解方式較為簡單。由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:準分子離子r0m/z284.071 4(理論m/z284.071 6)通過丟失1,2,4-三唑中性分子后可發(fā)生異構化,得到兩種結構的m/z215.138 5(理論m/z215.038 9)的r1和r2,該結構在易在ESI源轟擊下斷裂,因此該離子的質譜峰僅在一級質譜圖中可見。r1通過丟失丙烯中性分子得到m/z172.991 9(理論m/z172.991 9)的r3; r2丟失一分子丁烯得到m/z158.976 2(理論m/z158.976 3)的r4,繼而丟失一分子HCl可得到兩種形態(tài)的m/z122.999 6(理論m/z122.999 6)的r5和r6。從質譜圖中也可以看到較高豐度的m/z89.038 4。

第六類:三唑酮、烯唑醇、烯效唑、多效唑、戊唑醇、環(huán)丙唑醇、粉唑醇、四氟醚唑(圖1中6～13)。這8種三唑類殺菌劑結構相似,只個別原子、單雙鍵或羥基、酮基等不同,所以將這8種三唑類殺菌劑歸為一類進行討論。以戊唑醇為例,由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:準分子離子r0m/z308.152 1(理論m/z308.152 4)通過丟失1,2,4-三唑中性分子得到m/z239.054 5(理論m/z239.119 7)的碎片離子r1, r1異構化得到r2。r2丟失中性分子丁烷后得m/z181.059 3(理論m/z181.041 5)的r3,繼而丟失一分子甲醛得到m/z151.031 0(理論m/z151.030 9)的r4,異構化后丟失一分子乙炔得到m/z125.015 3(理論m/z125.015 3)的r5,繼續(xù)丟失中性分子HCl后得到m/z89.038 4(理論m/z89.038 6)的r6。

第七類:腈菌唑、腈苯唑(圖1中14～15)。這兩種殺菌劑主鏈上含有腈基,此種結構與其他三唑類殺菌劑具有明顯區(qū)別,將這兩種殺菌劑單獨討論。以腈菌唑為例[19],由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:其中準分子離子r0m/z289.121 2(理論m/z289.121 5)首先丟失1,2,4-三唑中性分子后得到m/z220.088 6(理論m/z220.088 8)的r1,繼而丟失中性分子丙烯得到m/z178.041 8(理論m/z178.041 8)的r2, r2丟失一分子HCN得到m/z151.030 7(理論m/z151.030 9)的r3,繼續(xù)丟失一分子乙炔得到m/z125.015 2(理論m/z125.015 3)的r4,該結構丟失中性分子氯化氫得到m/z89.038 4(理論m/z89.038 6)的r5。r1還可分別通過丟失中性分子丁烯得到m/z164.026 2(理論m/z164.026 2)的r6,丟失乙烯得到m/z192.057 14(理論m/z192.057 5)的r7。

第八類:氟環(huán)唑、糠菌唑、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑(圖1中16～19)。這4種三唑類殺菌劑結構中均含有環(huán)氧烷結構,裂解方式較為特殊,因此將這4種三唑類殺菌劑作為同一類進行討論。以糠菌唑為例,由二級質譜圖推測其可能的裂解途徑如下:準分子離子r0m/z375.961 2(理論m/z375.961 4)首先丟失1,2,4-三唑中性分子后經過分子內異構化形成更穩(wěn)定的m/z306.928 9(理論m/z306.928 7)的r1, r1脫去中性分子溴化氫得到m/z227.002 7(理論m/z227.002 5)的r2, r2打開含氧六元環(huán)結構形成r3,丟失中性分子CO形成m/z199.006 9(理論m/z199.007 6)的r4, r4丟失中性分子丙炔形成m/z158.976 3(理論m/z158.976 3)的r5, r5丟失中性分子氯化氫得到m/z122.999 6(理論m/z122.999 6)的r6或r7; r4還可丟失中性分子丁炔形成m/z144.960 6(理論m/z144.960 6)的r8。

2.2 三唑類殺菌劑質譜裂解規(guī)律

根據上述討論的三唑類殺菌劑裂解途徑,大部分三唑類殺菌劑的三唑環(huán)以取代基的形式與主鏈相連,同時結構中一般含有取代苯。因此在ESI源條件下,解離過程是首先丟失三唑環(huán)(產生m/z70.034 0 的特征碎片或者產生m/z69.032 7 的特征丟失),然后丟失中性小分子,以小分子烯烴居多。當化合物結構中存在一元鹵素取代時,會出現(xiàn)m/z125.015 3、m/z89.038 6 的特征碎片,而當結構中存在二元鹵素取代苯結構時,會出現(xiàn)m/z122.999 6、m/z89.038 6 的特征碎片離子。以戊唑醇為代表的三唑類殺菌劑與以腈菌唑為代表的三唑類殺菌劑的差別僅為:前者是以羥基取代而后者是以腈基取代,因此在斷裂過程中此部分丟失的中性小分子不同,其他解離過程基本類似。而三環(huán)唑、唑嘧菌胺這類可產生共軛體系的化合物在解離過程中會打開三唑環(huán),繼而丟失中性分子HCN,因此在篩選時可以設置單獨的篩選條件如:設置特征碎片離子m/z163.032 4、m/z136.021 5 和中性丟失HCN來專門篩選三環(huán)唑;設置特征碎片離子m/z249.207 4、m/z176.093 1、m/z149.082 2 和中性丟失HCN、C7H16來專門篩選唑嘧菌胺。

2.3 裂解規(guī)律驗證

應用上述裂解規(guī)律,將未進行裂解途徑分析的11種三唑類殺菌劑標準品進行篩選方法的驗證。使用MSE掃描模式對11種標準品(粉唑醇、氟環(huán)唑、三唑酮、四氟醚唑、丙環(huán)唑、腈苯唑、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、烯效唑、烯唑醇、多效唑)進行二級碎片離子全掃描,并使用1.5節(jié)中的篩選方法進行提取,結果如表3所示,所有標準品均可用該方法篩選出來,表明本研究中得到的三唑類殺菌劑的裂解規(guī)律可作為非靶向篩查的依據。

表 3 11種三唑類殺菌劑標準品的篩選結果Table 3 Screening results of 11 triazole fungicide standards

表 4 11種三唑類殺菌劑的基質效應Table 4 Matrix effect of 11 triazole fungicides

2.4 基質效應考察

基質效應研究采用基質配制的標準溶液與純標準溶液的峰面積之比表示。11種三唑類殺菌劑的基質效應見表4。結果表明,這11種殺菌劑均為基質抑制,特別是氟環(huán)唑、三唑酮和烯效唑。為最大限度降低基質效應干擾,本研究采用基質匹配法進行分析。以空白樣品的提取液為標準溶液的稀釋溶液,可使標準溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境,從而降低基質效應。

2.5 實際樣品測定

圖 4 西紅柿樣品和烯唑醇標準溶液的色譜圖及二級碎片質譜圖Fig. 4 Chromatograms and secondary fragment ion spectra of diniconazole in a tomato sample and reference standard solutiona. Base peak ion (BPI) chromatogram of a tomato sample; the small picture: candidate compound [M+H]+m/z 326.0820; b. secondary fragment ion spectrum of diniconazole in a tomato sample; c. BPI chromatogram of diniconazole reference standard; d. secondary fragment ion spectrum of diniconazole (10 mg/L standard).

使用MSE模式對北京市售16份西紅柿樣品進行二級碎片離子全掃描,并使用1.5節(jié)中的篩選方法進行提取,在1份西紅柿樣品中檢測到標識性碎片離子m/z70.034 0、m/z89.038 6、m/z122.999 6 和中性丟失碎片m/z27.994 9(CO),m/z35.976 7(HCl),m/z56.062 6(C4H8),準分子離子為m/z326.082 0 的可疑化合物。根據標識性碎片離子m/z70.034 0 推測該化合物可能是一種三唑類殺菌劑,母離子具有9∶6∶1的同位素峰表明該化合物具有二氯取代,再由中性丟失C4H8可推測結構中可能含有異丁基,丟失CO可推測結構中可能含有羥基或羰基取代。根據表3,我們推測樣品中可能含有烯唑醇。進一步采用標準品進行驗證。烯唑醇的標準品色譜圖為圖4c,保留時間為4.74 min),質譜圖為圖4d(母離子為 326.082 0,子離子為 158.976 1 和 70.039 5),而在實際樣品中(見圖4a和4b),保留時間為4.76 min,母離子和子離子分別為 326.082 0、158.976 2 和 70.039 7,這和標準品的保留時間和質譜信息一致,由此我們確認該西紅柿樣品中含有烯唑醇,由此也驗證了本文中推測的三唑類殺菌劑質譜裂解規(guī)律。

3 結論

本文分析了19種常用的三唑類殺菌劑的結構特點,將其分為8類,通過四極桿飛行時間質譜對其中有代表性的8種化合物進行分析,總結了三唑類殺菌劑的質譜裂解規(guī)律,鑒定出三唑類殺菌劑的標識性碎片和典型中性丟失碎片,實現(xiàn)了西紅柿中三唑類殺菌劑的非靶向篩查。