曹夢(mèng)陽(yáng) 林浩成* 姜 輝*

1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）2. 北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（北京 100191）3. 北京大學(xué)第三醫(yī)院男科（北京 100191）4. 北京大學(xué)第三醫(yī)院人類精子庫(kù)（北京 100191）

約15%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾， 其中男性因素導(dǎo)致的不育約占50%[1]。 男性不育癥是由多種疾病和因素造成的結(jié)果， 但超過一半的男性不育患者無法找到明確的病因，臨床上稱為特發(fā)性男性不育，目前認(rèn)為其發(fā)病與遺傳和環(huán)境等因素有關(guān)。 因此，從分子遺傳學(xué)的角度精確的闡釋生精功能障礙的發(fā)病機(jī)制，是未來治療特發(fā)性男性不育癥的基礎(chǔ)。 植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白7（PHD finger protein 7，PHF7）屬于RING 型泛素連接酶家族，在人和小鼠的睪丸組織中特異性表達(dá)[2]。PHF7 在2002 年被首次報(bào)道，Junhua Xiao 等研究了一例PHF7 基因缺陷的生精阻滯患者，認(rèn)為其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控及調(diào)節(jié)精子發(fā)生的作用[3]。 2012 年，Shuyuan Yang 等發(fā)現(xiàn)，PHF7 可以調(diào)控果蠅性別分化過程， 這種調(diào)控作用可能與其識(shí)別組蛋白甲基化修飾H3K4me2 有關(guān)[4，5]。在本研究中，我們?cè)隗w外表達(dá)GST-PHF7 融合蛋白，篩選其在人精子中的相互作用蛋白， 并通過生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行富集，從蛋白質(zhì)層面探明PHF7 及其互作蛋白在精子發(fā)生中的調(diào)節(jié)通路，為進(jìn)一步研究PHF7 及其互作蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制打下基礎(chǔ)， 并為基因突變引起的男性不育的診斷和治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、GST-PHF7 表達(dá)載體的構(gòu)建

全基因合成少量質(zhì)粒作為模板， 設(shè)計(jì)引物Plasmid-PHF7-F （ 序 列5'—3'：GATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGAAGACTGTAAAAGAAAAGAAG） 及Plasmid-PHF7-R （ 序 列 5'—3'：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTACTTGGATTTTTTGCAGC） 并 使 用PrimeSTAR 高保真酶（Takara，R045A）擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件：96℃20s，60℃30s，72℃1min， 共30 個(gè)循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取含目的基因片段的條帶，使用DNA 回收試劑盒（生工，B518131）回收DNA 目的片段，得到目的基因PCR 產(chǎn)物。

取5μg 的pGEX-4T-1 載體， 用BamHI 和XhoI 在37℃雙酶切30min，電泳回收載體片段。 按照如下方案配置目段片段與載體連接的反應(yīng)體系：pGEX-4T-1 載體片段100ng，PHF7 PCR 產(chǎn)物100ng，5x CE II Buffer 4μL，ExpressII （諾唯贊，C112-2）2μL，ddH2O 補(bǔ)充到20μL。 37 ℃連接30min 后， 取10μL 連接產(chǎn)物至100 μL Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30 min，42 ℃水浴60s，然后快速將其轉(zhuǎn)移至冰浴中2～3 min。 加入300μL LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，將菌液均勻涂布于含Amp 抗生素（100 μg/mL）的LB 平板上，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉(zhuǎn)移入37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑選菌落進(jìn)行PCR 鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，菌落PCR 鑒定得到的陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提（生工，B518191）。

二、GST-PHF7 融合蛋白的表達(dá)與純化

挑取表達(dá)GST 標(biāo)簽重組蛋白的單克隆， 接種到3mL 含Amp 抗生素的LB 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜。 按照1:100 的比例取培養(yǎng)過夜的菌液，接種到預(yù)熱至37℃并含Amp 抗生素的LB 培養(yǎng)液中，37℃常規(guī)培養(yǎng)60min至菌液的OD600 達(dá)到0.6 左右。 將菌液在冰上靜置，加入IPTG 至終濃度為0.5mM 28℃進(jìn)行誘導(dǎo)。 收集菌液至離心管中，4℃1500g 離心3min， 棄上清， 收集沉淀。 以PBS 50 倍體積進(jìn)行濃縮。1000pa 壓力進(jìn)行壓力破碎，共重復(fù)7 次。 1500g 離心20min，取上清進(jìn)行后續(xù)純化。

將制備好的含有GST 融合蛋白的澄清細(xì)胞裂解液加入到層析柱中，流速控制為10～15cm/h。 裂解液全部流出層析柱后就立刻加入1×PBS 清洗柱子， 所需量大約為柱體積的20 倍。 用10～15 倍柱體積的現(xiàn)配10mM谷胱甘肽洗脫液 （0.154g 還原性谷胱甘肽溶于50 mL 50 mM Tris-HCl,pH 8.0） 洗脫融合蛋白。 分別吸取20μLGST 融合蛋白原液、流出液、洗滌液和洗脫液，通過SDS-PAGE 電泳分析各樣品， 確定是否存在標(biāo)簽蛋白。洗脫液通過分子篩（30Kda 超濾管）去除游離的谷胱甘肽并濃縮。

三、精子總蛋白提取

收集2018 年10 月到11 月在北京大學(xué)第三醫(yī)院男科精液檢查室的精液廢棄標(biāo)本，根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版[6]，篩選出精子濃度和活力均正常的精液標(biāo)本。 取15mL 離心管，依次加入2mL 90% percoll，45% percoll 和液化精液， 保持各液體之間的界面清晰，300 g 離心20 min。 去上清后用PBS清洗細(xì)胞沉淀2 次，向其中加入蛋白裂解液（已加蛋白酶抑制劑），冰上裂解15min，500g 4℃離心15min，取上清到新的EP 管中即為精子總蛋白。

四、GST pull-down 實(shí)驗(yàn)

取GST 空載菌和GST-PHF7 菌， 加入PBS 溶液，渦旋震蕩混勻，4℃1500g 離心5min，去上清，重復(fù)洗滌沉淀兩次。 加入裂解液，吹打混勻后冰上裂解，5%功率超聲5min。 4℃1500g 離心15min，上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，做好標(biāo)記，從每管中取50uL 作為input。取適量樹脂到EP 管中， 加入1mL 細(xì)胞裂解液， 室溫漂洗2min，500g 4℃離心5min，去掉液體，在漂洗兩次后，加入上清，在EP 管上做好標(biāo)記，命名為GST 組+精子蛋白、GST-PHF7 組+裂解液、GST-PHF7 組+ 精子蛋白，放入4℃混勻儀上孵育2h。 從4℃混勻儀上拿出樹脂，4℃500g 離心5min，去上清，向樹脂中加入1mL 裂解液， 放混勻儀上， 室溫漂洗5min 后，4 ℃500g 離心5min，去上清重復(fù)漂洗兩次。 將提取的精子細(xì)胞蛋白加入到相應(yīng)的樹脂組別中，放4℃混勻儀上孵育過夜。 孵育完畢后4℃500g 離心3min，棄上清。 將樹脂用裂解液洗3 次， 用新鮮配置的20mM 還原性谷胱甘肽洗脫15min。 4℃1500g 離心5min,上清即為pull-down 產(chǎn)物。將3 組pull-down 產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

五、質(zhì)譜檢測(cè)與生信分析

將樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，獲取與PHF7 特異結(jié)合的蛋白序列和分子量等信息， 該部分委托廣州駿輝生物科技有限公司完成。 使用Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）進(jìn) 行GO 富 集 分 析[7]； 使 用KEGG pathway 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）信號(hào)通路富集分析[8]；使用在線軟件Omics-Bean（http//www.omicsbean.cn）作圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、GST pull-down 實(shí)驗(yàn)與質(zhì)譜分析

GST 組+ 精 子 蛋 白、GST-PHF7 組+ 裂 解 液、GST-PHF7 組+ 精子蛋白三組pull-down 產(chǎn)物SDSPAGE 結(jié)果如圖1 所示，可見GST-PHF7 組+精子蛋白組與另外兩組條帶有明顯差異。 結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)用誘餌蛋白成功釣取了精子細(xì)胞中的結(jié)合蛋白。 將pull-down 產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)， 質(zhì)譜得到的GST-PHF7的結(jié)合蛋白除去GST 對(duì)照組鑒定的蛋白后， 共鑒定到75 個(gè)直接或間接相互作用的蛋白。 對(duì)這些蛋白進(jìn)行注釋，注釋出組蛋白及其變體、轉(zhuǎn)錄因子、氧代謝相關(guān)蛋白等。

圖1 GST pull-down 實(shí)驗(yàn)考染膠圖

二、PHF7 相互作用蛋白的GO 富集分析

對(duì)質(zhì)譜得到的蛋白依次從生物學(xué)過程（Biological Process，BP），細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecule Function，MF）層面進(jìn)行GO 功能富集分析，共注釋出BP 條目2273 個(gè)，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條目（P＜0.05）1377 個(gè)；注釋出CC 條目375 個(gè)，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條目（P＜0.05）236 個(gè)； 注釋出MF 條目401 個(gè)，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條目（P＜0.05）240 個(gè)。 各自取可信程度最高（根據(jù)P 值排列）的10 個(gè)條目，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 PHF7 互作蛋白在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能層面的富集分析

PHF7 互作蛋白涉及到蛋白運(yùn)輸(intracellular protein transport)，細(xì)胞內(nèi)定位(cellular localization)，藥物代謝（Drug metabolic process）和分解代謝(Catabolic process)等多個(gè)生物學(xué)過程，根據(jù)P 值篩選出可信度最高的10 個(gè)條目繪制氣泡圖如圖3 所示。 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能在level 4 水平上,富集蛋白最多的是細(xì)胞器復(fù)合體代謝（Organonitrogen compound metabolic process）和運(yùn)輸（transport）的分布如圖4 所示。 每個(gè)蛋白可能同時(shí)分屬不同的生物學(xué)過程， 若將每個(gè)蛋白依據(jù)P 值大小歸到可信程度最高的條目下， 涉及蛋白最多的條目是藥物代謝（Drug metabolic process），其分布如圖5 所示。

圖3 PHF7 互作蛋白涉及的可信度最高的10 個(gè)生物學(xué)過程

圖4 PHF7 互作蛋白涉及的生物學(xué)過程在level4 水平上的分布

圖5 PHF7 互作蛋白涉及的生物學(xué)過程分布餅圖

PHF7 互作蛋白主要定位在各種胞內(nèi)細(xì)胞器（intracellularvesicle），細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)，囊泡(vesicle)，外泌體(extracellular exosome)等，涉及胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸和分泌的多個(gè)環(huán)節(jié)， 這些細(xì)胞成分在level4 水平上的分布如圖6 所示。每個(gè)蛋白可能同時(shí)分屬不同的細(xì)胞成分條目，若將每個(gè)蛋白依據(jù)P 值大小歸到可信程度最高的條目下，64%的蛋白定位于胞外膜界細(xì)胞器（Extracellular membrane-bounded organelle），其次是胞質(zhì)（cytoplasm），其分布如圖7 所示。

圖6 PHF7 互作蛋白所涉及的細(xì)胞成分在level4 水平上的分布

圖7 PHF7 互作蛋白所涉及的細(xì)胞成分分布餅圖

PHF7 互作蛋白涉及到蛋白結(jié)合（protein binding），RNA 結(jié)合(RNAbinding)和酶結(jié)合(enzymebinding)等分子功能， 根據(jù)P 值篩選出可信度最高的10 個(gè)條目繪制氣泡圖如圖8 所示。 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能在level 4 水平上的分布如圖9 所示,識(shí)別與結(jié)合核酸是其主要分子功能。每個(gè)蛋白可能同時(shí)分屬不同的分子功能條目，若將每個(gè)蛋白依據(jù)P 值大小歸到可信程度最高的條目下，71%的蛋白分子功能被歸類于蛋白結(jié)合，其分布如圖10 所示。

圖8 PHF7 互作蛋白涉及的可信度最高的10 個(gè)分子功能

圖9 PHF7 互作蛋白分子功能在level4 上的分布

圖10 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能分布餅圖

三、PHF7 相互作用蛋白的KEGG 分析

KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中，信號(hào)通路分為以下6 個(gè)亞類：代謝（metabolism）；遺傳信息處理（genetic information processing）；環(huán)境信息處理（environmental information processing)；細(xì)胞過程（cellular processes);生物體系統(tǒng)organismal systems)和人類疾?。╤uman diseases）。 PHF7互作蛋白共注釋出KEGG 通路118 條， 其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路（P＜0.05）27 條，其分布如圖11 所示。 結(jié)果表明，這些蛋白涉及代謝，遺傳信息處理，生物體系統(tǒng)和人類疾病4 個(gè)亞類， 富集基因較多的通路有代謝大類中的代謝通路（metabolic pathways），糖代謝（glycolysis）,氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）等，在遺傳信息的處理大類中涉及核糖體（ribosome）,在人類疾病中涉及帕金森病，阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病等。 可信度最高的十條富集通路根據(jù)P 值從小到大排列依次是 核 糖 體 （ribosome）， 丙 酮 酸 代 謝（pyruvate metabolism），大腸埃希菌感染（Pathogenic Escherichia coli infection），帕金森?。≒arkinson’s disese），氧化磷酸化 （Oxidative phosphorylation）， 代 謝 通 路（metabolic pathways）, 亨廷頓病 （Huntington’s diaease）， 糖代謝（glycolysis），藥物代謝（drug metabolism），阿爾茨海默癥（Alzhemer’disease），繪制氣泡圖如圖12。 KEGG 結(jié)果表明，PHF7 在精子中的相互作用蛋白要參與了細(xì)胞代謝和遺傳信息處理的多種信號(hào)通路。

討 論

蛋白相互作用的研究是揭示蛋白作用機(jī)制的重要手段，之前的針對(duì)果蠅的研究中，我們對(duì)PHF7 在精子發(fā)生中的作用有了初步的了解。盡管PHF7 基因在不同物種之間的序列高度保守，但PHF7 在果蠅和哺乳動(dòng)物中的位置及表達(dá)模式等差異很大， 哺乳動(dòng)物和人類的生精過程調(diào)節(jié)機(jī)制也更為復(fù)雜，PHF7 在精子發(fā)生中的具體分子機(jī)制尚不清楚。 因此， 我們構(gòu)建質(zhì)粒并表達(dá)GST-PHF7 融合蛋白，通過體外實(shí)驗(yàn)釣取其在人精子中的互作蛋白，并通過生物信息學(xué)方法分析其富集通路，為進(jìn)一步研究PHF7 在精子發(fā)生中的作用機(jī)制提供探索方向和理論基礎(chǔ)。

GST pull-down 法和免疫共沉淀法是篩選細(xì)胞內(nèi)與已知蛋白和位置蛋白相互作用的經(jīng)典方法。 GST pull-down 法是將GST-PHF7 融合蛋白作為探針固定到凝膠柱上，與精子細(xì)胞總蛋白中的目的蛋白結(jié)合。 由于體外實(shí)驗(yàn)不同于細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境， 部分蛋白可能會(huì)由于分子力或者電荷相互作用與融合蛋白結(jié)合； 部分蛋白雖能與PHF7 直接相互作用，但由于在精子細(xì)胞內(nèi)的空間分布不同，生理環(huán)境下無法直接接觸，這些因素可能會(huì)造成假陽(yáng)性[9]。 免疫共沉淀法可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體， 這種蛋白復(fù)合體不一定是蛋白與蛋白之間的直接結(jié)合， 可能有其他蛋白在中間起橋梁作用使無關(guān)蛋白與其間接結(jié)合， 從而造成假陽(yáng)性。 本研究同時(shí)進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和GST pull-down 實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證，現(xiàn)有抗體無法在自然狀態(tài)下拉下PHF7 相互作用蛋白復(fù)合體，而GST pull-down 法則成功釣取PHF7 蛋白復(fù)合體， 故本研究使用GST pull-down 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)和進(jìn)一步分析。 本次共鑒定出75 個(gè)與PHF7 直接或間接相互作用蛋白， 其中大部分未被已知的STRING 蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)收錄[10]。

圖11 PHF 互作蛋白在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中的富集通路

圖12 PHF 互作蛋白富集通路氣泡圖

GO 功能富集和KEGG 代謝通路注釋是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方法，PHF7 的互作蛋白被顯著富集在數(shù)個(gè)功能和代謝通路中， 為進(jìn)一步驗(yàn)證其在精子發(fā)生中的功能提供了研究方向。 GO 富集分析的結(jié)果表明，PHF7 的互作蛋白在細(xì)胞組分上定位在從胞內(nèi)細(xì)胞器、囊泡到細(xì)胞膜上， 涉及細(xì)胞器代謝和蛋白運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過程，這和其在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的定位是一致的[11]。 精子發(fā)生后期，圓形的單倍體精子細(xì)胞將經(jīng)歷一系列的變形過程， 最終形成成熟精子。 精子形成過程中，組蛋白先被過渡核蛋白替代，然后又被魚精蛋白所取代。 其中一個(gè)關(guān)鍵的過程是組蛋白，過渡蛋白等關(guān)鍵蛋白的胞內(nèi)定向運(yùn)輸和降解。 這次注釋出的組蛋白及其變體，核糖體蛋白R(shí)PL，翻譯起始因子eIF，和熱休克蛋白HSP 家族等，均參與了精子發(fā)生過程中蛋白合成，運(yùn)輸和代謝過程[12，13]。 這在一定程度上暗示了PHF7 及其互作蛋白可能的調(diào)節(jié)機(jī)制， 即在關(guān)鍵蛋白的裝配和運(yùn)輸上發(fā)揮作用。 在分子功能上，PHF7 的互作蛋白注釋出了酶結(jié)合，蛋白結(jié)合和核酸結(jié)合的條目，這和其在表觀遺傳學(xué)層面調(diào)節(jié)精子發(fā)生的功能是相符合的[14，15]。在KEGG 的信號(hào)通路注釋中，PHF7 互作蛋白大多富集在各種代謝通路上，包括氧化磷酸化，丙酮酸代謝和糖代謝等， 這些關(guān)鍵蛋白的缺失均會(huì)影響生精功能[16，17]?？紤]到PHF7 的互作蛋白有約10%富集在線粒體代謝復(fù)合體和呼吸鏈上， 對(duì)精子細(xì)胞能量代謝的影響可能是其另一種作用機(jī)制。 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，PHF7 基因敲除小鼠的精子活力明顯下降（數(shù)據(jù)未發(fā)表），PHF7 基因缺失影響了精子線粒體代謝是一種可能的解釋。 此外，KEGG 的結(jié)果提示部分蛋白（NDUFS7，UQCR，ATP5F等） 可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病和阿爾茨海默癥等有關(guān)， 在這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中這些基因的表達(dá)也表現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性[18-20]。 考慮到PHF7 在腦組織中也有少量表達(dá)，而一些基因如DJ-1 也可同時(shí)涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病和男性不育[21]，PHF7 及其互作蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中也可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。 但由于本實(shí)驗(yàn)存在著一定的假陽(yáng)性可能， 富集在神經(jīng)系統(tǒng)疾病通路的基因相比于背景基因也并不多，PHF7 及其互作蛋白是否能在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用仍待進(jìn)一步的確認(rèn)。