趙卿宇 沈 群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院;植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)是禾本科大麥屬的一種禾谷類(lèi)作物，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥，主要產(chǎn)自中國(guó)西藏、青海、四川、云南等地[1]。青稞具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可食用、釀造或用作牧區(qū)牲畜越冬時(shí)的飼料。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于青稞的研究主要集中在青稞的營(yíng)養(yǎng)潛力、飼用價(jià)值、食品和工業(yè)利用等[2]，而作為青稞品質(zhì)的另一重要特征指標(biāo)—香氣組分在國(guó)內(nèi)外研究甚少，青稞的香氣組分是一類(lèi)非常復(fù)雜，數(shù)目龐大的物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)各不相同。

青稞香氣組分提取常采用頂空固相萃取[3]和同時(shí)蒸餾萃取技術(shù)[4]，香氣組分分析常用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]。然而傳統(tǒng)的GC-MS法存在同分異構(gòu)體難以鑒別、操作復(fù)雜以及設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，難以在國(guó)內(nèi)推廣普及[6]，因此需要開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、高通量和結(jié)果直觀的鑒定方法。氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)作為一種新的聯(lián)用技術(shù)，將氣相分析技術(shù)的簡(jiǎn)易快捷與離子遷移譜的高分辨、高準(zhǔn)確度分析有機(jī)融合。GC-IMS不僅克服了IMS分離效率差的局限性，而且充分發(fā)揮了氣相色譜的超高分離效率和離子遷移譜的高靈敏性，該方法目前已成功應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[7-9]。本研究采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)29種青稞的揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用PCA和Fisher判別分析建立不同青稞的判別模型，以期為青稞風(fēng)味物質(zhì)的分離鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建及風(fēng)味物質(zhì)的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

29種青稞品種由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供，其中以X2DM開(kāi)頭的24種為藏大麥品種，剩余5種為藏青2000，藏青320，冬青18，茍籽粒和隆里。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec 1H1-00053 型氣相色譜-離子遷移譜：配CTC CombiPAL自動(dòng)頂空進(jìn)樣裝置；交聯(lián)毛細(xì)管柱(15 m×0.25 mm×0.50 μm，德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

頂空進(jìn)樣條件頂空孵化溫度：95 ℃；孵化時(shí)間：17 min；加熱方式：振蕩加熱，轉(zhuǎn)速500 r/min；頂空進(jìn)樣針溫度：98 ℃；進(jìn)樣量：500 μL，不分流模式；用高純N2(純度≥99.999%)推動(dòng)和清洗頂空針；清洗時(shí)間： 0.5 min。

GC條件色譜柱類(lèi)型FS-SE-54-CB-115 mI D:0.53 mm；柱溫：40 ℃；運(yùn)行時(shí)間：10 min；載氣(高純N2，純度≥99.999%)；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min 內(nèi)線性增至150 mL/min。

IMS條件漂移管長(zhǎng)度：5 cm；管內(nèi)線性電壓：400 V/cm；漂移管溫度：40 ℃；漂移氣(高純N2，純度≥ 99. 999%)；流速：150 mL/min；IMS 探測(cè)器溫度：45 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-IMS 在正離子模式下通過(guò)有線網(wǎng)絡(luò)傳輸并保存到計(jì)算機(jī)中，每張譜圖平均掃描32 次，使用網(wǎng)格脈沖寬度為100 μs，重復(fù)率為21 ms，采樣頻率為150 kHz。對(duì)樣品揮發(fā)性有機(jī)成分的指紋數(shù)據(jù)采用軟件LAV 2.0.0和MatlabR2016b處理完成。

GC-IMS三維譜中特征峰選取原則GC-IMS三維譜中每個(gè)特征峰代表1種揮發(fā)性有機(jī)成分，以不同樣品中特征峰的有無(wú)或者特征峰強(qiáng)度變化為原則，手動(dòng)選擇并以長(zhǎng)方形標(biāo)記特征峰所在區(qū)域，以該特征峰區(qū)域的峰強(qiáng)度(即特征區(qū)域離子強(qiáng)度的最大值)作為參數(shù)變量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

PCA分析和Fisher分類(lèi)判別采用SPSS22.0軟件和OriginPro9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 29種青稞GC-IMS譜圖分析

如圖1所示，隨機(jī)選取三種藏大麥和藏青320、冬青18的GC-IMS譜圖，直觀觀察樣品譜圖之間的區(qū)別。從直觀上看，不同青稞在GC-IMS三維圖譜上存在差異，具體體現(xiàn)在出峰位置、數(shù)量以及對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度。三種藏大麥樣品之間比較相似，而藏青320、冬青與藏大麥之間的差別很大，這為后續(xù)青稞的分類(lèi)提供了可能。

依據(jù)特征峰選取原則，通過(guò)GC-IMS將選取的青稞品種中不同有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)應(yīng)的特征峰區(qū)域進(jìn)行排序?qū)φ?，得到如圖2所示的指紋圖譜。圖2中X軸為選取的特征峰標(biāo)識(shí)號(hào)，Y軸為樣品編號(hào)。圖2

圖1 5種青稞的GC-IMS對(duì)比圖

圖2 29種青稞樣品揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜對(duì)比

表1 分類(lèi)模型結(jié)果表

注：1為藏大麥系列，2為非藏大麥系列。

每一行代表一個(gè)青稞樣品中全部的揮發(fā)性有機(jī)物信息，每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同青稞樣品中的信息，每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越高。通過(guò)GC-IMS分析得到的指紋圖譜，可直觀和快速看出29種青稞品種的完整特異性揮發(fā)性有機(jī)物以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物含量的差異。

由圖2可知，29種青稞品種所含的香氣組分種類(lèi)基本相似，但含量差異較大。在24種以X2DM開(kāi)頭的藏大麥品種中，X2DM0052含有的特異性揮發(fā)有機(jī)物較多,其中紫色框中表示X2DM0052的特殊信號(hào)峰(含量比其他高)。另外5種青稞品種(藏青2000和320、冬青18、隆里和茍芝粒)中，綠色框中表示藏青2000的特殊信號(hào)峰(含量比其他高)；黃色框中表示藏青320的特殊信號(hào)峰(峰137含量比其他高很多，而其余兩個(gè)比其他較高)；紅色框中表示茍芝籽的特殊信號(hào)峰(含量比其他高)。

2.2 主成分分析

通過(guò)不同特征區(qū)域的排序?qū)Ρ瓤纱笾屡袆e青稞品種，但仍受限于觀察者的主觀性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)GC-IMS三維譜的數(shù)字化表達(dá)。故以選取的特征峰對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度值為特征參數(shù)變量進(jìn)行主成分分析，得到圖3。由圖3可知，不同青稞品種的GC-IMS數(shù)據(jù)經(jīng)PCA處理后，可以較好地區(qū)分部分類(lèi)別的青稞品種。以X2DM開(kāi)頭的24種藏大麥樣品在PCA圖中橫跨區(qū)域范圍較大，這與樣品采集自不同的區(qū)域有關(guān)，間接說(shuō)明了GC-IMS對(duì)青稞產(chǎn)地鑒別的可能性。藏青2000、藏青320、茍籽粒與24種藏大麥樣品可以明顯區(qū)分，其中茍籽粒與藏大麥區(qū)別最大；冬青18和隆里則和藏大麥比較相似，無(wú)法做到有效區(qū)分。除此之外，還發(fā)現(xiàn)藏青2000、藏青320、冬青18、茍籽粒和隆里彼此之間距離較大，說(shuō)明五種青稞在香氣組分上具有明顯的差異。

圖3 29種青稞的主成分分析

2.3 Fisher判別分析

Fisher判別法是先對(duì)樣本進(jìn)行方差分析，將樣本的種類(lèi)區(qū)分出，然后依據(jù)方差分析的結(jié)果進(jìn)行線性判別分析，區(qū)分不同個(gè)體。Fisher線性識(shí)別作為一種分類(lèi)方法已經(jīng)被成功的應(yīng)用在大米[10]、蕎麥[11]、茶葉[12]等。Fisher判別的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)分布、方差等都沒(méi)有限制，應(yīng)用范圍較廣，且依此法建立的判別方程可直接用手工計(jì)算的方法進(jìn)行新觀察對(duì)象的判別，非常方便。對(duì)29種青稞里面選取的特征峰對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度值進(jìn)行Fisher分類(lèi)識(shí)別，分別選擇不同品種青稞中的80%樣品作為訓(xùn)練集，20%作為預(yù)測(cè)集，建立分類(lèi)模型，具體情況如表1所示。訓(xùn)練結(jié)果如表2所示，樣品識(shí)別正確率為100%。為了全面的檢測(cè)模型的預(yù)測(cè)能力，本研究選擇結(jié)合預(yù)測(cè)集校檢和留一交叉驗(yàn)證法對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，鑒別結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)集校驗(yàn)和留一交叉驗(yàn)證對(duì)模型的檢測(cè)結(jié)果分別為85.71%、100%和92.68%、100%。預(yù)測(cè)結(jié)果都在85%以上，均達(dá)到了定性判別的要求，初步說(shuō)明該模型穩(wěn)健、可靠，能用于不同青稞品種區(qū)分。

表2 訓(xùn)練集識(shí)別結(jié)果

表3 Fisher判別函數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

采用GC-IMS聯(lián)用分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的不同青稞種類(lèi)判別方法。對(duì)青稞中的香氣成分進(jìn)行了分析，GC-IMS圖譜清晰，對(duì)比明顯。以GC-IMS三維譜中的特征峰強(qiáng)度作為表征青稞品質(zhì)信息的特征參數(shù)，并使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分類(lèi)判別。結(jié)果表明，藏青2000、藏青320、冬青18、茍籽粒和隆里在香氣組分上具有明顯的差異，其中藏青2000、藏青320、茍籽粒與24種藏大麥可以明顯區(qū)分，而冬青18和隆里則和藏大麥比較相似；建立Fisher判別分析模型，選擇預(yù)測(cè)集校檢和留一交叉驗(yàn)證法對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，訓(xùn)練集的識(shí)別率為100%，驗(yàn)證結(jié)果正確率均在85%以上，達(dá)到定性分析的要求，初步表明該模型穩(wěn)健、可靠，能用于不同青稞品種區(qū)分。由此可見(jiàn)，依據(jù)青稞中香氣成分信息對(duì)不同青稞進(jìn)行分類(lèi)和判別是可行的，GC-IMS技術(shù)可望發(fā)展成為快速高效的青稞指紋信息鑒別技術(shù)。