趙孟浩，馮祎濃，尹玉文，李承前，孫國杰,*

（1.河北科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018;2.河北禾盛源生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，河北 唐山 063000）

生物體在新陳代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量ROS會(huì)對DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子產(chǎn)生損傷。炎癥出現(xiàn)的一個(gè)重要因素就是ROS的增加[1]。研究表明，炎癥可使主動(dòng)脈脂質(zhì)異常積聚，形成粥樣斑塊，導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生[2]。內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)不足以完全防止損傷，因此從外部補(bǔ)充抗氧化劑對于維持機(jī)體健康至關(guān)重要[3]。丹酚酸B作為丹參水溶性成分中含量最高的功能性物質(zhì)[4]，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)證明丹酚酸B有抗氧化和清除自由基的能力。大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[5-7]也表明，丹酚酸B作為丹參中活性最強(qiáng)的水溶性物質(zhì)有很強(qiáng)的抗氧化能力[8]。

腸道作為藥物消化吸收的主要場所，在藥物代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。對編碼基因比人類基因組還要多100 倍的腸道微生物來說，不僅在營養(yǎng)物質(zhì)的消化過程[9]中扮演著重要的角色，在代謝[10]和免疫[11-12]中依然起著重要的作用。大量的研究表明，腸道微生物群落的失調(diào)和異常會(huì)導(dǎo)致糖尿病[13]、心血管疾病[14]、肝病[15]和肥胖癥[16]等多種疾病。丹酚酸B和腸道微生物都被證實(shí)和心血管疾病相關(guān)，而對于丹酚酸B和腸道微生物之間關(guān)系的研究較少。丹酚酸B屬于多酚物質(zhì)，多酚物質(zhì)在腸道中主要的調(diào)節(jié)方式有2 種：一種是為微生物提供代謝底物，促進(jìn)有益菌的繁殖;另一種是利用抗菌活性抑制有害菌的繁殖?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了針對丹酚酸B的體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)和腸道微生物群落分析，研究丹酚酸B對腸道微生物的影響，為治療心血管疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1003。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所;Stool Genomic DNA kit糞便基因組DNA提取試劑盒北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;蛋白濃度測定試劑盒 北京Solarbio科技有限公司;丹酚酸B為自制品（含量83.8%）;其他溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPR-11-10T超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SpectraMax i3酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司;DYY-6C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;Ketagalan GL凝膠成像分析系統(tǒng) 美國威泰克公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

將30 只SPF級(jí)昆明小鼠于日光燈照明下，12 h晝夜交替，溫度（25±1）℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。小鼠分成5 組：正常組（NC組，灌胃生理鹽水）、丹酚酸B低劑量組（L組，灌胃30 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B中劑量組（M組，灌胃60 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B高劑量組（H組，灌胃120 mg/kgmb丹酚酸B）、VC陽性對照組（PC組，灌胃100 mg/kgmbVC）。每組6 只，標(biāo)記后稱量并記錄初始體質(zhì)量，每日上午9∶00通過灌胃給藥，給藥42 d。

1.3.2 樣品采集

末次給藥24 h后，將所有小鼠分隔開，收集糞便。每組選取4 只小鼠糞便進(jìn)行基因組的提取。通過眼球采血方式收集血液，3 500 r/min離心10 min取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。斷頭脫臼處死小鼠，取小鼠心、肝、腎、脾組織，稱質(zhì)量用于計(jì)算臟器指數(shù)。將肝臟組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 小鼠糞便基因組提取和處理

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）;806R（5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，HiSeq2500 PE250上機(jī)測序[17]。

1.3.4 指標(biāo)檢測

小鼠體質(zhì)量的變化量按照式（1）計(jì)算。

式中：m1為灌胃不同時(shí)間后的體質(zhì)量/g;m2為最初體質(zhì)量/g。

小鼠臟器指數(shù)按式（2）計(jì)算。

按照試劑盒說明檢測MDA的含量和SOD、GSH的活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

腸道微生物群落利用LEfSe軟件對差異組間進(jìn)行分析，先對所有組樣品間進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)（一種多樣本比較時(shí)常用的檢驗(yàn)方法），將篩選出的差異再通過wilcoxon秩和檢驗(yàn)（一種兩樣本成組比較常用的檢驗(yàn)方法）進(jìn)行兩兩組間比較，最后篩選出的差異使用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）展示[18]。默認(rèn)展示P＜0.05、LDA＞2的菌群。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。若方差齊，差異采用LSD法進(jìn)行多重比較，若方差不齊則采用Games-Howell比較。測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠糞便細(xì)菌基因組的提取

圖 1 小鼠糞便細(xì)菌基因組電泳圖Fig. 1 Electropherogram of mouse fecal bacterial genome

圖 2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electropherogram of polymerase chain reaction amplified products

每組選取4 只小鼠糞便進(jìn)行糞便基因組的提取，提取后電泳圖如圖1所示。從每組4 個(gè)基因組中選取3 個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小465 bp，擴(kuò)增后電泳圖如圖2所示。擴(kuò)增后產(chǎn)物條帶位置正確，條帶清晰，無雜帶，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠體質(zhì)量的變化

表 1 小鼠體質(zhì)量的變化（n＝ 6）Table 1 Changes in body mass of mice (n= 6)g

由表1可知，小鼠在灌胃丹酚酸B 6 周之后，各實(shí)驗(yàn)處理組相對于正常組體質(zhì)量變化沒有顯著差異。

2.3 小鼠臟器指數(shù)

表 2 小鼠臟器指數(shù)（n＝ 6）Table 2 Mouse organ coefficients (n= 6)

臟器指數(shù)增大表明臟器充血、水腫和增生肥大。臟器指數(shù)減小則是發(fā)生了臟器萎縮和其他退行性變化[19]。由表2可知，在灌胃6 周后，小鼠心臟和脾臟的臟器指數(shù)沒有差異?？墒歉闻K和腎臟的臟器指數(shù)卻值得關(guān)注。肝臟中，中劑量、高劑量和陽性對照組相對于正常組臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。腎臟中，高劑量相對于正常組臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）;陽性對照組相對于正常組極顯著降低（P＜0.01）。對于肝臟和腎臟是否是出現(xiàn)了病變，還需要進(jìn)一步的組織切片觀察。針對目前得到的結(jié)果可知，丹酚酸B水溶性成分的主要靶器官是肝臟和腎臟。這與Li Xiaochuan等[20]在大鼠口服丹酚酸B后，得到丹酚酸B各組織中水平由高到低的順序（腎＞肺＞肝＞心＞脾＞腦）相似。

2.4 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中SOD活力的影響

Wang Yingchun等[21]通過實(shí)驗(yàn)得到，丹酚酸B可以通過保護(hù)肝臟線粒體的方式，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程，治療非酒精性脂肪性肝炎。丹酚酸B對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化也具有一定的抗肝損傷作用，減少肝臟膠原沉積和氧化損傷[22]。所以本實(shí)驗(yàn)只測定肝臟和血清中SOD活力，灌胃6 周丹酚酸B后，只有血清中陽性對照組相對于正常組顯著增加;隨著丹酚酸B劑量增加，肝臟和血清中的SOD活力同樣增加（表3）。組別 肝臟SOD活力/（U/mg） 血清SOD活力/（U/mL）

表 3 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中SOD活力的影響（n＝ 3）Table 3 Effect of salvianolic acid B on SOD activity in liver and serum of mice (n= 3)

2.5 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中MDA水平的影響

組別 肝臟MDA含量/（nmol/mg） 血清MDA濃度/（nmol/mL）

表 4 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中MDA水平的影響（n＝ 3）Table 4 Effect of salvianolic acid B on MDA levels in liver and serum of mice (n= 3)

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可用作評(píng)估氧化應(yīng)激的指標(biāo)[23]。由表4可知，在肝臟中，高劑量組相對于正常組MDA有顯著性降低（P＜0.05），在血清中，中劑量組相對于正常組有顯著性降低（P＜0.05），高劑量組和陽性對照組相對于正常組極顯著性降低（P＜0.01）。說明丹酚酸B在中、高劑量時(shí)，和VC一樣具有減輕機(jī)體受到氧化應(yīng)激的功能。這與Chen Yonghong[24]和Ma[25]等得到的結(jié)果相似，他們指出丹酚酸B可以顯著抑制脂質(zhì)過氧化，并在缺血再灌注模型中增強(qiáng)SOD活性，提高GSH含量。

2.6 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中GSH含量的影響

表 5 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中GSH含量的影響（n＝ 3）Table 5 Effect of salvianolic acid B on GSH contents in liver and serum of mice (n= 3)

由表5可知，肝臟中GSH含量在各組中沒有顯著性變化，而在血清中、高劑量組GSH濃度顯著增加（P＜0.05），相較于陽性對照組增加更多。

2.7 微生物群落差異分析結(jié)果

2.7.1 樣品多樣性指數(shù)分析結(jié)果

圖 3 操作分類單元稀釋性曲線Fig. 3 Rarefaction curves of operational taxonomic units

圖 4 Rank abundance曲線Fig. 4 Rank abundance curves

如圖3所示，各樣品的稀釋曲線已經(jīng)趨于平緩，測序量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于曲線拐點(diǎn)量，說明本研究樣本測序深度及覆蓋度足夠，其測序深度可以代表大多數(shù)微生物種類。如圖4所示，Rank abundance曲線在水平橫軸上的跨度較大，分類的豐富度較高。在垂直方向上曲線平緩，物種分布均勻。相對豐度高于10-3的菌種在各樣本中都較少，隨著菌群數(shù)量逐漸增加，樣本豐度降低。在菌群豐度至10-5時(shí)，曲線接近平臺(tái)期。大部分樣品測得的菌屬在400～600之間。

圖 5 Shannon稀釋曲線Fig. 5 Shannon rarefaction curves

如圖5所示，各藥物組均比正常組Shannon指數(shù)大，表示各藥物組樣品菌群豐富度增加，曲線趨于平緩，測序深度增加已經(jīng)不影響物種多樣性，測序量趨于飽和。

2.7.2 菌群組成分析結(jié)果

圖 6 門水平下微生物種類分布圖Fig. 6 Microbial composition at phylum level

如圖6所示，在門分類水平下，給藥組相對于正常組，除Firmicutes（厚壁菌門）上升外，Bacterbidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Actinobacteria（放線菌門），其他菌門相對豐度均下降。

圖 7 種水平下微生物種類分布圖Fig. 7 Microbial composition at species level

如圖7所示，在種水平下給藥組與正常組比較，主要是Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis兩種菌相對豐度增加。給藥組中Bacteroides uniformis菌相對正常組相對豐度降低，降低程度大于陽性對照組。

2.7.3 LEfSe菌群差異分析結(jié)果

圖8A展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。礊榫€性判別分析值）。隨后通過將差異映射到已知層級(jí)結(jié)構(gòu)的分類樹上方式得到進(jìn)化分支圖（圖8B）。在進(jìn)化分支圖中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬（或種）的分類級(jí)別。篩選P＜0.05、LDA＞2的菌落進(jìn)行展示和比較，如圖8A1、B1所示，在灌胃低劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Bacteroides thetaiotaomicron兩個(gè)菌豐度增加明顯。厚壁菌門中LachnospiraceaeFCS020 group、Ruminiclostridium6兩個(gè)菌豐度增加明顯。放線菌門中Gordonibacter豐度增加明顯。如圖8A2、B2所示，在灌胃中劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和綠彎菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis兩個(gè)菌豐度增加明顯。厚壁菌門中mouse gut metagenome豐度增加明顯。綠彎菌門Chloroflexi豐度也有所增加，可是具體屬種并不知道。如圖8A3、B3所示，在灌胃高劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus，Parabacteroides distasonis兩個(gè)菌豐度增加明顯。厚壁菌門中mouse gut metagenome、Tyzzerella3、MollicutesRF9豐度增加明顯。放線菌門中Gordonibacter豐度增加明顯。圖8A4、B4所示，在灌胃VC后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis豐度增加明顯。厚壁菌門中Roseburia、MollicutesRF9豐度增加明顯。

圖 8 正常組和丹酚酸B各劑量組菌群差異分析Fig. 8 Analysis of differences between normal group and salvianolic acid B treatment groups

在灌胃低劑量和高劑量丹酚酸B實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)現(xiàn)放線菌門中Gordonibacter菌豐度增加明顯。該菌的兩個(gè)菌種Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378 T）和Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213 T）具有將鞣花酸代謝為尿石素的功能[26-27]。尿石素A（urolithin A，UA）是由鞣花單寧在腸道菌群中生成的一種天然代謝產(chǎn)物[28]。UA可以抑制髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，MPO是一種在多形核中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)的血紅素蛋白，其含量在炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）[29]和其他炎癥性疾病血漿中顯著增加[28]。

在對比生理鹽水組后，所有的藥劑組中Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis豐度均有增加。根據(jù)Yoshida等[30]的研究可知，灌胃具有活性的B. vulgatus和B. dorei至小鼠體內(nèi)，減弱動(dòng)脈粥樣硬化，明顯改善內(nèi)毒素血癥。通過減少腸道微生物脂多糖的產(chǎn)生，保護(hù)小鼠免于動(dòng)脈粥樣硬化。

Parabacteroides distasonis的豐度增加對改善IBD[31]、多發(fā)性硬化[32]、非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[33]和肥胖[34]有益處。通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Parabacteroides distasonis具有很強(qiáng)的將原發(fā)性膽汁酸轉(zhuǎn)化為二級(jí)膽汁酸的能力，所以該菌通過誘導(dǎo)膽汁酸代謝的變化改善ob/ob小鼠的脂質(zhì)代謝過程并能減輕NAFLD程度[35]。Koh等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Parabacteroides distasonis具有抗炎癥和抗腫瘤的效果，Parabacteroides distasonis通過減弱Toll樣受體4信號(hào)傳導(dǎo)和阻斷Akt活化，抑制小鼠結(jié)腸腫瘤的形成[36]。

3 結(jié) 論

在臟器指數(shù)統(tǒng)計(jì)中，肝臟和腎臟的臟器指數(shù)隨劑量增加而下降。小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，在沒有構(gòu)建損傷模型的情況下灌胃丹酚酸B，SOD活力只有增加的趨勢，在肝臟和血清中，各劑量組相較于正常組沒有顯著性增加。相較于正常組，GSH活力只在血清高劑量組中具有顯著性增加。相較于肝臟正常組，高劑量組MDA含量顯著性降低;相較于血清正常組，中劑量組MDA含量顯著性降低，高劑量組極顯著性降低。因此，丹酚酸B具有治療心血管疾病的作用。在口服丹酚酸B后，通過菌群差異分析發(fā)現(xiàn)Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis在給藥組中豐度均增加，且差異顯著。Parabacteroides distasonis具有抗炎抗腫瘤的功能，并參與膽汁酸的代謝過程。Bacteroides vulgatus可以抑制體內(nèi)脂多糖的產(chǎn)生，改善動(dòng)脈粥樣硬化。

通過以上實(shí)驗(yàn)，可知丹酚酸B具有體內(nèi)抗氧化活性，同時(shí)可以影響腸道菌群的構(gòu)成，然而是否通過上述已知功能菌群發(fā)揮藥理作用還需要進(jìn)一步研究。