王馨雨，楊綠竹，王 婷，王蓉蓉，劉 潔，單 楊，張 群，丁勝華,*

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125;3.吐魯番市林果業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，新疆 吐魯番 838000;4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

日本科學(xué)家Yoshida最早提出漆樹液汁變硬可能與某種活性物質(zhì)有關(guān)，隨后Keilin等從蘑菇中提取純化得到該物質(zhì)，并將其命名為多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）[1]。國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合命名委員會提出PPO有以下分類：1）單酚酶（EC 1.14.18.1）即酪氨酸酶;2）二酚酶（EC 1.10.3），包括兒茶酚氧化酶（EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）[2]，PPO是一類核基因編碼酶，受多個(gè)基因控制，主要存在質(zhì)體類囊體腔中，在植物中主要指兒茶酚氧化酶[2]。PPO對植物抵御外界脅迫、光合作用、生物合成等起重要作用，但在果蔬中PPO常引起負(fù)面效應(yīng)，使顏色、味道、營養(yǎng)等受到破壞，因此對PPO的抑制作用一直是研究熱點(diǎn)。Klabunde等[3]報(bào)道了甘薯PPO晶體結(jié)構(gòu)，并揭示了其活性中心，這促進(jìn)了分子水平上構(gòu)效關(guān)系及性質(zhì)的研究，為褐變控制提供了理論基礎(chǔ)和研究思路。目前對PPO的抑制以化學(xué)處理和漂燙熱處理為主，其他熱處理及非熱處理也正逐步發(fā)展，后者能夠更好地保留果蔬營養(yǎng)，但存在滅酶不完全、成本高等缺點(diǎn)，因此還未能廣泛應(yīng)用。在遺傳學(xué)方面，也有學(xué)者通過基因沉默或基因敲除手段抑制PPO表達(dá)，從而控制褐變，但因其基因家族和表達(dá)的復(fù)雜性，對其研究相對困難，離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。本文就近年來PPO的生理功能、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及褐變控制進(jìn)行綜述，在此基礎(chǔ)上，對酶促褐變的控制研究前景進(jìn)行展望。

1 PPO的生理功能

1.1 對抵御外界脅迫的影響

自然界植物受到外界脅迫時(shí)，其首先通過天然屏障（包括細(xì)胞壁、角質(zhì)層、蠟質(zhì)層、木質(zhì)素等）發(fā)揮作用[4]。酚類物質(zhì)是形成木質(zhì)素的前提，可促進(jìn)細(xì)胞壁和組織木質(zhì)化，而PPO是參與酚類聚合的酶，影響細(xì)胞壁中木質(zhì)素的合成[5]。病原菌侵染能誘導(dǎo)植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的積累，酚類物質(zhì)與PPO反應(yīng)形成的醌再與其他物質(zhì)交聯(lián)形成的物質(zhì)可作為物理屏障保護(hù)植物組織[2,6]。Thipyapong等[7]從基因?qū)用嫜芯堪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄PPO在正義表達(dá)中比反義表達(dá)表現(xiàn)出對昆蟲更強(qiáng)的抗性。酚類物質(zhì)的積累還被認(rèn)為與植物抵御非生物脅迫有關(guān)，在冷脅迫、水分脅迫、熱脅迫條件下均觀察到該現(xiàn)象[8-10]，這些酚類物質(zhì)與抑制PPO活性、增加抗氧化酶和活性氧清除劑酶活性相關(guān)[11]。

1.2 對光合作用的影響

目前普遍認(rèn)為PPO是一種質(zhì)體酶，存在于正常細(xì)胞的光合組織（葉綠體類囊體）和非光合組織質(zhì)體（如馬鈴薯塊莖細(xì)胞的造粉體）中[12]。PPO參與光合作用的猜想可分為兩種，間接影響和直接影響。間接影響的相關(guān)證據(jù)為PPO蛋白與光系統(tǒng)II存在關(guān)聯(lián);PPO活性與葉綠體產(chǎn)生高水平O2相關(guān);酚類物質(zhì)對光合作用磷酸化有抑制作用，這暗示PPO可以通過氧化植物體內(nèi)的底物來阻止這種抑制[12]。直接影響的相關(guān)證據(jù)為PPO可為光合作用起到氧緩沖作用,以促進(jìn)活性氧的清除。但是該猜想的局限性在于目前缺乏酚類物質(zhì)存在于葉綠體的證據(jù),同時(shí),與光合作用的速率相比,這種催化調(diào)節(jié)的速率相對緩慢[13]。

1.3 對生物合成的影響

Nakayama等[14]在金魚草中發(fā)現(xiàn)一種酶，它能催化查耳酮生成金魚草素，通過純化該酶并測序得到cDNA，預(yù)測的蛋白質(zhì)序列與其他植物PPO具有高度同源性。另外，體外實(shí)驗(yàn)表明來自脈孢菌的酪氨酸酶也可將查耳酮轉(zhuǎn)化為金魚草素[15]。由此推測，PPO可能參與了金魚草素的生物合成。但是，金魚草素合成酶N端無特異性的導(dǎo)肽，使其無法進(jìn)入質(zhì)體，并且這種酶的作用底物存在于液泡中的糖蛋白，不存在于質(zhì)體中，這對PPO存在于質(zhì)體的亞細(xì)胞定位問題提出了質(zhì)疑[12]。

1.4 其他生理功能

在甜菜植物中PPO被認(rèn)為參與甜菜堿的合成，但目前酪氨酸轉(zhuǎn)化為L-二羥基苯丙氨酸（L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）的證據(jù)還不完善[15]。Araji等[16]發(fā)現(xiàn)在PPO沉默的核桃植株中，酪氨酸的主要代謝物酪胺含量大量增加，而酪氨酸和3-羥基酪氨酸（酪氨酸酶的良好底物）含量顯著降低，并且酪胺的積累使葉片細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性壞死，由此認(rèn)為PPO介導(dǎo)核桃酪氨酸代謝。未成熟番茄及香蕉果實(shí)和幼葉中PPO的活性均分別顯著高于成熟果實(shí)和葉片，因此猜想它可能與植物生長發(fā)育有關(guān)[17]。

2 PPO對果蔬褐變的影響

雖然PPO對植物生理功能具有重要作用，但PPO引起的褐變反應(yīng)使受損果蔬造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。圖1為Gerdemann等[18]提出的酶促褐變反應(yīng)機(jī)理，PPO的活性部位由兩個(gè)銅原子組成，其在氧分子存在的條件下可催化單酚酶羥基化和將鄰二酚氧化為鄰醌;隨后醌類化合物被氧化成醌衍生物，形成的鄰醌與其他醌、氨基酸、蛋白質(zhì)非酶聚合形成褐色化合物[18-19]。雖然這種褐變反應(yīng)在紅茶、咖啡、可可豆的著色方面必不可少，但在多數(shù)果蔬中是不被期望的[20-21]。從營養(yǎng)角度來說，一方面，酶促褐變形成的醌類是一種不穩(wěn)定的化合物，醌的逆向歧化可形成半醌自由基，與氧氣結(jié)合會形成一系列活性氧簇，這些活性氧簇會對DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸或脂類造成損害[13];另一方面，果蔬中的許多酚類物質(zhì)，如綠原酸（蘋果、甘薯、生菜）、兒茶酚（西蘭花、茶葉、梨、葡萄、藍(lán)莓）、酪氨酸（蘑菇、核桃、馬鈴薯），對人體健康有重要作用，如可抗癌、抗炎、誘導(dǎo)雌激素活性;酶促褐變反應(yīng)會消耗底物酚類物質(zhì)，這對果蔬的營養(yǎng)價(jià)值造成一定損失[18]。因此，對PPO引起的褐變反應(yīng)控制一直是研究的熱點(diǎn)。

圖 1 單酚酶與二酚酶氧化反應(yīng)機(jī)理[18]Fig. 1 Oxidation mechanism between monophenolase and diphenolase[18]

3 PPO的提取與分離純化

酶促褐變的控制通常需要對PPO的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分離純化是研究性質(zhì)的第一步。在研究性質(zhì)時(shí)常使用純化倍數(shù)不高的粗酶液，而涉及其分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等信息時(shí)，則需純化至較高倍數(shù)。根據(jù)PPO來源的多樣性及性質(zhì)的差異性，應(yīng)選擇合適的方法，必要時(shí)可多種方法聯(lián)用以達(dá)到最佳效果。

3.1 提取

酶的來源不同，提取酶的試劑也有差異。鹽溶液用于提取在低濃度鹽中溶解度大的酶，有機(jī)溶劑用于提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶。由于酚類物質(zhì)會干擾酶的純化，為減緩這種不良反應(yīng)，研究者采用了以下手段：氮?dú)猸h(huán)境、低溫組織均質(zhì)化、添加酚醛吸收聚合物。Alici等[22]在用磷酸鹽提取琉璃苣PPO時(shí)添加聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、Triton X-100作為苯酚清除劑。植物中PPO存在兩種形式，游離態(tài)PPO（soluble PPO，sPPO）和結(jié)合態(tài)PPO（membrane-bound PPO，mPPO），mPPO在未激活前不表現(xiàn)出酶促活性。通常，在提取時(shí)需通過蛋白酶如胰蛋白酶[23]、蛋白酶K[24]或溫和洗滌劑[22,25]（如Triton X-100、Triton X-114、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））對酶激活。Liu Fang等[25]在提取富士蘋果mPPO時(shí)，添加抗壞血酸以及蛋白質(zhì)抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）和乙二胺四乙酸（edetic acid，EDTA）以防止酶的降解。Yoruk等[26]研究中提到在提取mPPO時(shí)添加其激活劑SDS，可使馬鈴薯葉中PPO活性提高4 倍，使蠶豆中PPO活性最大提高119 倍。

3.1.1 鹽溶液提取法

大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，且在低濃度鹽存在條件下，酶的溶解度隨鹽濃度升高而增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”效應(yīng)。提取效果的關(guān)鍵在于緩沖液的選擇。研究者在提取西米[27]、馬魯拉果[28]、龍葵果實(shí)[29]等植物的PPO時(shí)，常采用磷酸鹽緩沖液作為提取劑。提取PPO時(shí)為了給蛋白質(zhì)提供一個(gè)溫和環(huán)境，通常提取液的pH值在6.5～7.3之間（表1）。低濃度鹽緩沖液提取酶較為溫和，得率較高，但低濃度鹽緩沖液所需體積大，一般需經(jīng)過進(jìn)一步濃縮、提純才能進(jìn)一步進(jìn)行研究應(yīng)用。

表 1 鹽溶液提取PPO的方法Table 1 PPO extraction methods with salt solutions

3.1.2 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇也常用于沉淀蛋白質(zhì)[32]。主要是有機(jī)溶劑的存在使溶液介電常數(shù)降低，溶質(zhì)分子間靜電引力增大，互相吸引而凝集。相比鹽析法，有機(jī)溶劑法析出的蛋白質(zhì)沉淀更易過濾和離心，但易使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化使酶變性失活;因此，有機(jī)溶劑提取通常在-20 ℃低溫下進(jìn)行[33-34]。Tao Yiming等[35]在用磷酸鹽緩沖液提取PPO后，用丙酮進(jìn)一步純化得到2.5 倍純度、69.4%回收率的PPO。粗酶液與冷卻的丙酮混合得到的酶提取物稱為丙酮粉，Gong Zhiqing等[33]先將板栗PPO制成丙酮粉，用磷酸鹽緩沖液溶解，再用硫酸銨對其進(jìn)一步純化，得到4.19 倍純度的PPO。

3.2 純化

在多數(shù)研究中，PPO純化涉及的步驟為硫酸銨或有機(jī)溶劑沉淀后，經(jīng)過濾、離心、透析處理，再采用幾種色譜純化技術(shù)，如離子交換色譜、體積排阻色譜、疏水相互作用色譜等[36-37]。盡管用這種工藝純化酶能得到較好純化效果，但它仍具有許多缺點(diǎn)，例如成本高、耗時(shí)長等。溫度誘導(dǎo)相分離、雙水相萃取、三相分離技術(shù)等液-液萃取的技術(shù)也應(yīng)用于酶的純化[23,38-39]。

3.2.1 硫酸銨沉淀

所有蛋白質(zhì)表面都有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，在含水提取物中，加入過量的鹽會增加表面張力，最終增強(qiáng)蛋白質(zhì)疏水相互作用使其沉淀，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”效應(yīng)。多數(shù)研究人員已采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%～85%的飽和硫酸銨用于沉淀PPO（表2）。鹽析會使蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，卻不會使其變性失活，通常在4 ℃下進(jìn)行。但是，經(jīng)鹽析得到的酶沉淀含大量鹽成分，Derardja[31]和Liu Nana[37]等用Tris-HCl作緩沖液低溫透析除去沉淀中的鹽成分，也有許多學(xué)者通過超濾、層析等手段進(jìn)行后續(xù)純化處理。為提高酶提取效率，在用沉淀法提取酶時(shí)，需將提取液pH值調(diào)節(jié)至提取酶的等電點(diǎn)附近。

表 2 硫酸銨對不同來源PPO純化的影響Table 2 Effect of ammonium sulphate on the purification of PPO from different sources

3.2.2 雙水相萃取

表 3 雙水相萃取不同來源PPO純化的影響Table 3 Effect of aqueous two phase system on the purification of PPO from different sources

通常，雙水相萃取體系是由兩種互不相溶的聚合物/聚合物或聚合物/鹽的水溶液組成，利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離目的。如表3所示，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是雙水相萃取中使用最多的成分之一，多數(shù)研究者使用分子質(zhì)量1 500～8 000 Da的PEG和磷酸鹽/硫酸鹽組合。聚合物的分配行為取決于聚合物的相對疏水性[42]。體系的pH值影響蛋白質(zhì)的可電離基團(tuán)并改變蛋白質(zhì)表面電荷，隨著pH值增加，高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)/酶更多地分配到頂部相，低于等電點(diǎn)的酶則分布至底部相[43]。榅桲[40]、馬鈴薯[44]PPO提取物位于頂部相，而菠蘿[39]PPO提取則富集于底部鹽相。Vaidya等[44]探究了不同參數(shù)對馬鈴薯PPO純化的影響，得到最佳體系為pH 7.0、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%PEG-8000、28.5%磷酸鹽。Niphadkar等[45]則用雙水相萃取法對廢棄馬鈴薯中PPO進(jìn)行純化，得到的純化酶是粗酶活力的4.5 倍。雙水相萃取法是植物中PPO的有效初級純化步驟，其優(yōu)勢在于可大批量純化PPO，但聚合物產(chǎn)生的污染、難以回收是雙水相萃取中的一大難題。

3.2.3 溫度誘導(dǎo)相分離

溫度誘導(dǎo)相分離利用濁點(diǎn)萃取原理，以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變溫度參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。低溫時(shí)，處于臨界膠束濃度的表面活性劑在水溶液中完全溶解，當(dāng)溫度升至濁點(diǎn)溫度時(shí)，溶液變得混濁，此后通過離心可以將溶液分成兩個(gè)透明相，分別由接近臨界膠束濃度的表面活性劑的無膠束溶液與該表面活性劑的濃溶液組成[47]。Trition X-114是最常見的非離子表面活性劑，溫度誘導(dǎo)相分離法純化PPO的示例見表4。Onsa等[27]使用離子表面活性劑如SDS和脫氧膽酸鈉，以及非離子表面活性劑如Trition X-100、Trition X-114和Tween-80從西米中提取PPO，觀察到非離子表面活性劑較離子型表面活性劑提取效率高2～5 倍，尤其是具有較低疏水指數(shù)的Trition X-114更有效。選擇誘導(dǎo)溫度通常為4 ℃和35～37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間多為10～15 min。溫度誘導(dǎo)相分離得到的PPO純化倍數(shù)相對較低，通常作為純化的第一步，后續(xù)常與硫酸銨及色譜法聯(lián)用。

表 4 溫度誘導(dǎo)相分離對不同來源PPO純化的影響Table 4 Effect of temperature induced phase separation on the purification of PPO from different sources

3.2.4 三相分離

三相分離是一種簡單、經(jīng)濟(jì)且相對較新的生物分離純化技術(shù)，已有研究者用其分離純化蛋白質(zhì)尤其是酶、酶抑制劑、脂肪、多糖等[49]。根據(jù)譚顯東等[50]的劃分，三相分離萃取有5 類，酶的提取屬于第一類，包括有機(jī)相/水相萃取體系和形成的第三相。通常在粗提取物中加入硫酸銨作為鹽，叔丁醇為有機(jī)相，水與叔丁醇能完全混溶，但加入大量的硫酸銨時(shí)，溶液會分離為上層叔丁醇相、下層水相，中間層是新形成的酶的共聚物[51]。這其中可能是鹽析、共溶劑沉淀、滲透、親液效應(yīng)等協(xié)同作用的結(jié)果[52]。表5總結(jié)了三相分離法提取不同來源PPO的情況。純化的PPO并非都在中間沉淀相中純度最高，受pH值和分子質(zhì)量等影響，有時(shí)蛋白質(zhì)更傾向于保留在底層水相，這在馬鈴薯PPO的純化[52]中有所體現(xiàn)。此外，三相分離法用于純化過氧化物酶中也出現(xiàn)這種蛋白質(zhì)在底層水相的現(xiàn)象[53]。Niphadkar等[52]利用超聲波輔助三相分離法提取馬鈴薯皮中的PPO時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲輔助提高了酶純度和回收率，同時(shí)將分離時(shí)間從40 min縮短到5 min。三相分離技術(shù)應(yīng)用于PPO分離純化的研究目前不多，但該技術(shù)在其他酶如木瓜蛋白酶、番茄轉(zhuǎn)化酶的研究上已取得較好成效[54-55]。三相分離的純化效果與傳統(tǒng)的沉淀法和色譜法相比，有處理量大、簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢，但其缺點(diǎn)是純化倍數(shù)較低，因此比較適合大規(guī)模純化的第一步驟。此外，三相分離與雙水相分離技術(shù)相比避免了聚合物的回收和水污染等問題，更加綠色環(huán)保。

表 5 三相分離對不同來源PPO純化的影響Table 5 Effects of three-phase separation on the purification of PPO from different sources

3.2.5 色譜法

色譜法是最常用且純化效果最好的技術(shù)之一，目前常用的色譜方法有凝膠過濾色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、快速蛋白質(zhì)液相色譜等。從表6來看，純化不同來源PPO時(shí)選擇的色譜類型、色譜柱不同，選擇時(shí)主要根據(jù)酶和雜質(zhì)的類型、電荷、分子質(zhì)量等多方面考慮。色譜分離法一般在初步提取純化后使用[25,28,56-58]。進(jìn)色譜柱前需對粗酶液進(jìn)行多次透析過夜處理，磷酸鹽是最常用的試劑[56,59]，Tris-HCl緩沖液也常被用到[31,60]。為了獲取更高純化倍數(shù)，研究者通常多次使用色譜法進(jìn)行純化，如海棗PPO經(jīng)兩次色譜純化后，純化倍數(shù)從4.4提高至79.9，茄子PPO經(jīng)3 次純化后，純化倍數(shù)高達(dá)259[57-58]。還有的研究者在凝膠色譜之前對粗酶進(jìn)行超濾處理，使用特定的分子膜截留酶分子，以獲取更高的純化倍數(shù)[28]。對于吸附酶的洗脫，常采用pH值為6.0～8.0磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、Tris-HCl緩沖液。洗脫方式主要有線性洗脫與梯度洗脫。凝膠過濾色譜法根據(jù)分子質(zhì)量的大小分離不同組分，也可用于估計(jì)酶的分子質(zhì)量，Marrufo-Hernández等[60]利用Superdex 200 10/300 GL柱分離金冠蘋果PPO得到58 kDa的單體。在科研工作中，色譜法因其綠色溫和高效等優(yōu)勢得到廣泛使用，但這種方式要求性能設(shè)備高且操作周期較長。

表 6 色譜分離條件對不同來源PPO純化的影響Table 6 Effect of chromatographic separation conditions on PPO purification from different sources

4 PPO的酶學(xué)性質(zhì)

4.1 理化性質(zhì)

根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，測定酶的分子質(zhì)量一般使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）或非變性凝膠電泳（native polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）法，前者使酶分子變性，后者保留了酶的生物活性，但清晰度不如前者。因此在PPO分子質(zhì)量的測定中大多用SDS-PAGE法，少部分使用Native-PAGE法[38,48]。如表7所示，根據(jù)來源的不同，PPO的分子質(zhì)量范圍為31～144 kDa。有的研究人員在測定植物PPO分子質(zhì)量時(shí)獲得了不止一條帶，如Batista等[29]用SDS-PAGE法測定龍葵果實(shí)PPO分子質(zhì)量，得到約70 kDa的單帶，再用Trition X-100處理PPO，以改善蛋白的電泳遷移率，得到分子質(zhì)量分別為47 kDa和68 kDa的兩條帶，這表明相同來源的PPO可能存在不同的亞型，即同工酶。此外，Mishra等[58]用SDS-PAGE和Native-PAGE法測定茄子PPO分子質(zhì)量，SDS-PAGE法顯示其分子質(zhì)量為65 kDa，Native-PAGE顯示約為112 kDa，同時(shí)經(jīng)Superdex凝膠過濾色譜中測得PPO分子質(zhì)量也為112 kDa，由此推測具有活性的茄子PPO可能是一種同型二聚體。同樣的PPO二聚體現(xiàn)象在刺果番荔枝[56]、菠蘿蜜[35]中也被發(fā)現(xiàn)。果蔬成熟期不同，PPO的分子質(zhì)量也有差異，Cheema等[61]研究不同成熟期芒果PPO的分子質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，處于R1階段未成熟的芒果PPO表現(xiàn)出144 kDa的分子質(zhì)量，處于R2～R4中間階段均表現(xiàn)出53 kDa的條帶，R5～R6的過熟期PPO分子質(zhì)量又升至112 kDa。

pH值對PPO的影響在于改變酶表面的電荷影響其溶解度以及破壞其結(jié)構(gòu)。溫度則通過影響動力學(xué)性質(zhì)及氧溶解度改變酶的活性。PPO最適pH值和溫度都是對特定的底物而言，由表7可知，PPO的最適pH值為3.6～8.0，最適溫度為5～45 ℃不等。針對單一底物和酶來源，最適pH值可能不止一個(gè)。在沙漠松露中，催化鄰苯二酚氧化時(shí)存在兩個(gè)最適pH值，分別為3.6、7.0，說明同工酶的存在[62]。不同來源的PPO催化同一底物氧化時(shí)的最適pH值、溫度也不同。整體看來，PPO適合在弱酸性、30 ℃左右保持活性。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)植物、動物和真菌都具有兒茶酚氧化酶、酪氨酸酶和甲酚酶活性，在少數(shù)果蔬中缺乏單酚酶活性，如茄子[58]、蛇果[38]、杏[33]。無核葡萄PPO能催化鄰苯二酚和L-DOPA氧化，但不能催化單酚酪氨酸、二酚愈創(chuàng)木酚和咖啡酸、三酚焦沒食子酸和沒食子酸氧化[63]。PPO活性似乎與底物結(jié)構(gòu)有關(guān)，Mishra等[58]研究了11 種底物與PPO活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)相對于羥基，鄰苯二酚環(huán)結(jié)構(gòu)及較小的官能團(tuán)（4-甲基）是決定其活性的主要因素。米氏方程中Km常用于衡量底物對酶的親和性，Km越小，與酶的親和性越高，琉璃苣PPO與咖啡酸、燈籠果PPO與綠原酸、茄子PPO與4-甲基鄰苯二酚、沙漠松露PPO與酪氨酸的親和力最高（表7）[22,46,58,62]，Km分別為0.51、0.56、0.34 mmol/L和0.14 mmol/L。但親和力高的催化效率不一定高，如金冠蘋果中PPO與4-甲基鄰苯二酚的親和性是與鄰苯二酚親和性的4.0～5.8 倍，但從催化效率Kcat/Km或Vmax/Km來看，鄰苯二酚是前者催化效率的2.6 倍[60]。與酶親和力高的底物更易結(jié)合，從而發(fā)生一定程度的褐變，而與酶反應(yīng)使酶催化效率高的底物，能在最短的時(shí)間達(dá)到最大的褐變度。

表 7 不同來源果蔬中PPO的酶學(xué)性質(zhì)Table 7 Enzymatic properties of free and bound PPOs in fruits and vegetables

植物中的mPPO和sPPO分別位于葉綠體類囊體膜、和內(nèi)腔中。其中mPPO可以與類囊體膜發(fā)生弱結(jié)合或強(qiáng)結(jié)合，不參與酚類化合物的合成[25,38]。sPPO可能是mPPO活化或在成熟或衰老中自發(fā)釋放的[38]。研究者對sPPO的關(guān)注相對更多，如在海棗果[57]、茄子[58]、金冠蘋果[60]、芒果[61]等中，但在一些非熱處理下，如超聲、高靜水壓、脈沖電場等能增強(qiáng)酶的活性[25]，這引起了學(xué)者們對mPPO的關(guān)注。沙漠松露PPO在未經(jīng)SDS活化時(shí)，沒有表現(xiàn)出PPO的活性，經(jīng)SDS處理后，才能夠測出催化酪氨酸和鄰苯二酚的活性[62]。

4.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

PPO通常以無活性的前體形式存在。前體由N端導(dǎo)肽、中間高度保守的Cu原子結(jié)合區(qū)和C端疏水區(qū)3 個(gè)部分組成。N端導(dǎo)肽可引導(dǎo)PPO蛋白質(zhì)前體進(jìn)入類囊體膜，保守性低。C端疏水區(qū)也有導(dǎo)肽，能引導(dǎo)成熟的酶蛋白進(jìn)入類囊體中。Cu原子結(jié)合區(qū)是該酶的主要功能區(qū)，其他部分則對酶的構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)的形成和維持起作用，中間高度保守的Cu原子結(jié)合區(qū)富含His殘基，每個(gè)Cu與3 個(gè)His殘基相連，形成特有的三維活性部位[15]。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究，主要是進(jìn)行氨基酸序列模擬分析。獲取氨基酸序列的途徑主要有兩種，一種是對純化的酶進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得小分子肽段，再經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對整合所有氨基酸序列;另一種是通過基因克隆手段獲取氨基酸序列。

不同來源的植物PPO氨基酸序列相似但不完全相同，如菠菜、梨、桃、蠶豆、胡蘿卜、馬鈴薯、番茄、葡萄、蘋果的PPO氨基酸序列相似性達(dá)45%～95%[63]。不同植物PPO氨基酸序列不同，其高度保守的活性中心氨基酸特征也存在差異，Liu Fang等[25]對富士蘋果mPPO結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)其含有6 個(gè)α-螺旋、2 個(gè)β-短鏈、10 個(gè)無規(guī)卷曲，2 個(gè)Cu結(jié)合位點(diǎn)連接3 個(gè)His殘基，分別為CuA連接His191、His212、His221，CuB連接His344、His348、His378。而Klabunde等[3]提出的甘薯中CuA和CuB分別與His88、His118、His109和His244、His274、His240相連。經(jīng)分子對接發(fā)現(xiàn)PPO在富士蘋果中的活性中心主要由疏水氨基酸（His191、His221、Phe217、Try224、Phe374）形成的疏水口組成，在葡萄中則由His87、Phe113、Asn240、His243、Lys244、Gly257、Phe259、Ala262、Phe268組成[64]，這些氨基酸殘基可能在酶的催化位點(diǎn)起重要作用。彭益強(qiáng)等[65]研究了乙酰丙酮、溴乙酸等具有相對專一性的氨基酸基團(tuán)修飾劑，發(fā)現(xiàn)富士蘋果中PPO蛋白質(zhì)中酶活性中心的必需基團(tuán)有組氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基與色氨酸殘基。PPO的三維結(jié)構(gòu)模型研究一般基于數(shù)據(jù)庫中已建立的晶體結(jié)構(gòu)作為模板同源模建，齊曉娟[66]以甘薯PPO為模板，同源建模得到藕的PPO三維結(jié)構(gòu)，再用計(jì)算機(jī)進(jìn)行PPO靶酶結(jié)構(gòu)篩選，根據(jù)構(gòu)象篩選抑制劑，再對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)了21 種新型抑制劑。

5 酶促褐變的控制

PPO在植物生理功能中地位顯著，但會使果蔬發(fā)生褐變，從而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，必須抑制果蔬的酶促褐變以保持其色澤和營養(yǎng)。基于前文提到的褐變機(jī)制，褐變的控制主要可從4 個(gè)方面入手（圖2）：氧氣濃度的控制、酶活性的抑制、酚含量的控制、褐變反應(yīng)過程的控制。目前對抑制褐變的研究很多，過去主要集中在化學(xué)處理、熱處理方面，近來高壓、超聲、脈沖電場等控制技術(shù)已成為新的研究熱點(diǎn)。

圖 2 酶促褐變的控制機(jī)理及方法Fig. 2 Mechanisms and methods for enzymatic browning control

5.1 化學(xué)方法

根據(jù)抑制機(jī)理，化學(xué)抑制劑可分為還原劑、螯合劑、酸劑、酶抑制劑、酶處理劑和絡(luò)合劑[67]。常用的還原劑有抗壞血酸及其鹽和硫化物。抗壞血酸是一種維生素，較硫化物安全性更高，其抑制機(jī)制在于將醌還原成酚阻止醌的二次聚合反應(yīng)，并且能降低環(huán)境pH值，抑制酶活性。在大多數(shù)研究中，抗壞血酸表現(xiàn)出良好的抑制作用，在刺果番荔枝[56]、芒果[68]中，0.1 mmol/L的抗壞血酸能使PPO完全失活;在菠蘿蜜[35]、蛇果[38]中抑制50%的酶活力，抗壞血酸濃度分別需達(dá)到0.3、1.5 mmol/L。但也有研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸能與色素、內(nèi)源性酶和銅等金屬等中間體發(fā)生不可逆氧化，在蘋果汁中0.18 mmol/L的濃度只能維持4 h[67]。在含硫化合物中，L-半胱氨酸作為一種生物體內(nèi)常見的氨基酸，在控制蛇果[38]、黃金梨[69]、生姜[70]等果蔬褐變中效果顯著。其主要抑制機(jī)制是與醌類結(jié)合形成無色化合物抑制黑色素的形成。但是它的缺陷在于有一種難聞的氣味，限制了其使用。偏亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鉀等硫化劑因其強(qiáng)還原性表現(xiàn)出非常強(qiáng)的PPO活性抑制效果，但出于安全考慮其正逐漸被其他健康的抑制劑替代，如曲酸、谷胱甘肽、托酚酮、槲皮素等。

曲酸主要通過發(fā)酵產(chǎn)生，它對幾種曲霉菌、蘑菇、某些植物（茄子、金冠蘋果、刺果番荔枝、芒果等）和甲殼類動物的PPO活性具有抑制作用，并能有效地抑制色素的形成和氧的吸收，它被認(rèn)為是過渡金屬離子的螯合劑、自由基清除劑，還能將褐變色素化學(xué)還原為無色化合物，從而使黑色素變白[67]。托酚酮在結(jié)構(gòu)上類似于鄰二酚基質(zhì)，可作為有效的銅離子螯合劑，在酶促反應(yīng)中起競爭性抑制劑的作用，在刺果番荔枝[56]、芒果[68]中，0.1 mmol/L酚酮就能使酶完全失活，在金冠蘋果[60]中，0.1 mmol/L酚酮也能使酶失去90%活力。還原性谷胱甘肽與半胱氨酸類似，通過將鄰醌還原成無色二酚來抑制反應(yīng)，或者通過與鄰醌不可逆地相互作用來防止聚合并形成穩(wěn)定的無色產(chǎn)物，在蛇果[38]、菠蘿蜜[35]中分別以0.15、0.45 mmol/L濃度達(dá)到半抑制酶活性效果。

4-己間基苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）是一種公認(rèn)安全的間苯二酚衍生物，已成功用于杏[31]、梨[71]、蘋果汁[72]褐變的控制。在杏中，與其他10 種抑制劑相比，0.1 mmol/L 4-HR最有效，僅保留了34%的PPO活力[31]。動力學(xué)研究表明，4-HR通過不可逆抑制梨褐變[71]，但也有研究表明4-HR抑制PPO活性是由于抑制劑在還原復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)的競爭性結(jié)合[73]，這可能與底物有關(guān)。酸化劑，如檸檬酸、蘋果酸或磷酸，可通過降低食品中的pH值或螯合銅來抑制PPO活性，但pH值過低產(chǎn)生的味道可能使消費(fèi)者難以適應(yīng)。β-CD是一種具有疏水內(nèi)腔的低聚物，可將酚類物質(zhì)捕獲形成包合物，避免其與PPO直接接觸，以控制褐變。Tao Yiming等[35]用β-CD抑制菠蘿蜜PPO活性，在β-CD濃度為1 mmol/L時(shí)基本無效，在4、10 mmol/L下，PPO活力分別下降16.5%和21.3%，但β-CD與4-HR、抗壞血酸結(jié)合具有很好的協(xié)同作用[74]。除了專用抑制劑之外，蜂蜜、原花青素、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、鱈魚肽、果蔬（洋蔥、辣椒、菠蘿）提取物等也用于褐變抑制研究，它們主要是通過內(nèi)在抗氧化物如黃酮、酚類物質(zhì)等抗氧化性起作用[70,75]。金屬鹽抑制效果不明顯，用于褐變抑制的應(yīng)用較少。菠蘿蜜中添加0.1～1.0 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+，PPO均表現(xiàn)活性增加[35]，Palma-Orozco等[68]用0.1～10 mmol/L的Mg2+、Mn2+、Zn2+處理芒果PPO，PPO活性隨濃度升高而增強(qiáng)。這些金屬離子可能與底物和/或PPO結(jié)合，從而有利于底物與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)酶催化作用，導(dǎo)致活性增強(qiáng)[68]。相似的激活和微弱的抑制效果在刺果番荔枝[56]、杏[31]、芒果[68]中也有體現(xiàn)。但螯合劑EDTA與金屬銅活性位點(diǎn)結(jié)合抑制效果顯著，得到了廣泛應(yīng)用。

5.2 物理方法

5.2.1 熱處理

熱處理是最廣泛使用的穩(wěn)定食品的方法，它同時(shí)具有殺滅微生物和滅活酶的能力。漂燙是果蔬加工中最常用的熱處理方式。通常，PPO熱失活主要受溫度和時(shí)間的影響，溫度70～90 ℃能破壞PPO催化活性，但失活所需時(shí)間取決于原料[53,58]。經(jīng)熱動力學(xué)研究，PPO的失活主要遵循一級動力學(xué)，在海棗[57]、梨[76]、菠蘿[77]、沙漠松露[62]等均有體現(xiàn)。高溫?zé)釥C導(dǎo)致酶變性失活，也會破壞熱敏營養(yǎng)物質(zhì)，不適合應(yīng)用于軟性水果。另外，它會導(dǎo)致維生素、碳水化合物和其他水溶性成分的損失，引起質(zhì)構(gòu)、色澤的變化，且會消耗大量水和能源，須處理廢物，增大了經(jīng)濟(jì)成本。新型的熱處理方式如微波、歐姆加熱、紅外等技術(shù)的非液體環(huán)境減少了水溶性物質(zhì)及營養(yǎng)物的流失，正逐漸替代漂燙熱技術(shù)。經(jīng)輕度微波處理（90 W、165 s），馬梅PPO活性增加，在高功率微波（590～937 W、30 s以上）時(shí)能完全失活[78]，板栗仁在微波處理（640 W、60 s）下完全失活[79]，鱷梨在功率密度11 W/g下處理80 s，PPO活性降低了80%[80]。經(jīng)電子顯微鏡觀察，馬梅在微波后經(jīng)漂燙處理，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞更小[78]。Benlloch-Tinoco等[81]模擬獼猴桃PPO失活與微波功率和時(shí)間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PPO活性與功率呈正線性和負(fù)二階相關(guān)，與時(shí)間呈正線性和正二階相關(guān)。歐姆加熱通過食品本身的介電性質(zhì)，在食品物料內(nèi)部將電能轉(zhuǎn)化為熱能，引起食品溫度升高，達(dá)到直接均勻加熱殺菌和滅酶效果，該技術(shù)多用于液體食品如甘蔗汁[82]、椰子汁[83]、西瓜汁[84]中，其溫度通?？刂圃?0～90 ℃。由于樣品中介電離子的運(yùn)動，歐姆加熱可能發(fā)生電化學(xué)變化，從而引起pH值的浮動[84]。

5.2.2 超高壓處理

一般認(rèn)為壓強(qiáng)超過100 MPa為超高壓，超高壓技術(shù)應(yīng)用于PPO的抑制，主要有高靜水壓（high hydrostatic pressure，HPP）和動態(tài)高壓微射流（dynamic highpressure microfluidization，DHPM）。如HPP對PPO的滅活效果不僅與壓力、時(shí)間等工藝條件有關(guān)，還與酶源有關(guān)（表8）。Fernandez等[85]利用響應(yīng)面研究HPP處理對果蔬混合汁的最佳控制效果，在627.5 MPa、20 ℃條件下處理6.4 min，PPO活力降低了10%，抗氧化活性提高了75%，微生物數(shù)量減少，顏色得到改善。Liu Wei等研究了DHPM對梨[86]和蘑菇[87]PPO活性的影響，發(fā)現(xiàn)對梨和蘑菇進(jìn)行多次處理后，PPO活性均顯著上升，未出現(xiàn)降低，這可能與DHPM技術(shù)的短時(shí)（低于5 s）和低壓（60～200 MPa）處理?xiàng)l件有關(guān)[86]。在相同的條件下，不同來源果蔬的抗性不同。經(jīng)高壓（600 MPa）處理5 min后，草莓PPO活力降至原來的63%，而梨和蘋果PPO活力則分別升高了26%、94%[88]。相似情況也在荔枝[89]、芒果[90]中有發(fā)現(xiàn)。用DHPM技術(shù)對富士蘋果PPO粗酶液處理，發(fā)現(xiàn)壓力為34～172 MPa時(shí)，PPO活性均下降[91]。相對低的溫度（20～34 ℃）和中低等壓強(qiáng)（100～400 MPa）條件下，PPO被激活可能的原因是壓力改變了酶的二、三級結(jié)構(gòu)，構(gòu)象改變激活了潛在PPO活性，增加了底物相互作用或蛋白質(zhì)C端延伸的裂解導(dǎo)致更活躍的活性中心位點(diǎn)的產(chǎn)生[92]。HPP對果蔬中褐變控制作用顯著，并能保護(hù)活性物質(zhì)（黃酮類、酚類、抗壞血酸、類胡蘿卜素等）免受熱處理損害，但不同酶的耐壓性不同，有必要嚴(yán)格控制壓力、時(shí)間、溫度等工藝變量，避免PPO的活化。

表 8 高靜水壓處理對不同來源PPO活性的影響Table 8 Effect of high hydrostatic pressure processing on PPO activity from different sources

5.2.3 高密度二氧化碳處理

高密度二氧化碳（dense phase carbon dioxide，DPCD）技術(shù)又稱為超臨界CO2（supercritical carbon dioxide，SCCD）和高壓聯(lián)合CO2（high pressure carbon dioxide，HPCD）技術(shù)。食品與高于超臨界壓力（7.38 MPa）和溫度（31.1 ℃）的CO2接觸，可通過降低細(xì)胞pH值、誘導(dǎo)酶構(gòu)象變化、誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)碳酸鈣和鎂的沉淀及破壞細(xì)胞等作用使PPO和微生物失活[98]。DPCD處理時(shí)典型的CO2壓力在4～30 MPa，很少超過50 MPa，溫度則在20～50 ℃[99]。表9顯示了不同條件下PPO活性的差異。相同溫度（35 ℃）下，與壓力（30～60 MPa）相比，時(shí)間（0～30 min）對草莓汁PPO活性影響更大[98]。在相對較低壓力下（18 MPa、45 ℃）測得蘋果汁20% PPO殘留[99]。此外，在更溫和條件下（10 MPa、35 ℃、15 min）還發(fā)現(xiàn)PPO活性的增加[100]。Xu Zenghui等[101]在22 MPa、60 ℃下則觀察到蘋果汁PPO完全失活。在不同溫度（35～45 ℃）和壓力（10～20 MPa）下對金冠蘋果濁汁進(jìn)行酶失活動力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)一級動力學(xué)模型可較好地描述失活曲線，但Weibull模型擬合效果更好[102]。DPCD與HPP有許多相似性，與HPP處理（400 MPa、25 ℃、10 min）相比，DPCD（30 MPa、65 ℃、15 min）處理的滅酶率更高，分別為12.4%、50.2%[94]。與熱處理相比，木瓜汁分別經(jīng)熱（65 ℃）和DPCD（20 MPa、65 ℃）處理20 min，酶活力保留率分別為34.18%、7.40%[103]。DPCD處理后PPO的穩(wěn)定性較好，草莓汁PPO經(jīng)處理失去83%的活性后，在6 ℃環(huán)境貯藏12 周未出現(xiàn)酶活性上升現(xiàn)象[98]。除了表型分析外，PPO經(jīng)DPCD處理滅活后，其結(jié)構(gòu)的變化能更深層地解釋酶失活的機(jī)理。Li Renjie等[100]研究了具有高PPO活性的類甜蛋白（thaumatinlike protein，TLP）在DPCD處理下結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)PPO的失活是由TLP的聚集和催化中心的坍塌造成。

表 9 高密度二氧化碳處理對不同來源PPO活性的影響Table 9 Effect of dense phase carbon dioxide processing on PPO activity from different sources

5.2.4 脈沖電場處理

脈沖電場（pulsed electric field，PEF）是一種新興的非熱性食品保鮮技術(shù)，在兩個(gè)電極的腔室中放入液態(tài)或半液態(tài)的食品，在微秒內(nèi)施加高強(qiáng)度（15～80 kV/cm2）的高壓脈沖，能有效滅活微生物和酶[106]。表10顯示了不同PEF處理?xiàng)l件下，果蔬中PPO的活性變化。Salinas-Roca等[107]研究了恒定電場強(qiáng)度（35 kV/cm2）、脈沖頻率（200 Hz）、脈沖寬度（4 μs）下，不同時(shí)間（50～2 000 μs）對芒果汁微生物和酶活性的影響，不超過1 800 μs處理，PPO活性與初始狀態(tài)比較不僅無顯著下降，還存在活性升高及營養(yǎng)丟失現(xiàn)象，經(jīng)1 800 μs處理，酶活力最低下降至初始時(shí)的70%，霉菌和酵母菌數(shù)量顯著減少。Zhong Kui等[108]報(bào)道了緩沖溶液中PPO的殘留活性與電場強(qiáng)度呈良好的正線性關(guān)系，回歸系數(shù)為0.933。在相對低的場強(qiáng)下，PEF對酶的活性影響很小，甚至可能激活潛在酶，也能誘導(dǎo)果蔬應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如類胡蘿卜素（南瓜）[109]、花青素（李子）[110]、己醛（番茄）[111]。溫度的升高對PEF滅酶有一定的輔助作用，隨著脈沖時(shí)間的延長，溫度升高。在用PEF處理（電場強(qiáng)度3 kV/cm2、脈沖頻率200 Hz）藍(lán)莓時(shí)，其中心溫度隨時(shí)間的延長逐漸升高，在前2 min PPO活力隨溫度升高而增強(qiáng)，最高相對酶活力達(dá)220%，隨后酶活力逐漸下降，在5 min時(shí)，中心溫度達(dá)88 ℃時(shí)PPO完全失活[112]。經(jīng)50 ℃預(yù)熱，再經(jīng)PEF處理，蘋果汁PPO的相對活力降低至29%，與常規(guī)巴氏殺菌（72 ℃、26 s）相比，PEF的滅酶效果好于巴氏殺菌（52%）[113]。不同酶源PPO對PEF處理有不同的抗性，在相同條件下（25 kV/cm2、25～28 ℃、66 μs），樹莓PPO的抗性大于藍(lán)莓PPO，樹莓、藍(lán)莓PPO相對活力分別為98%和80%[114]。PEF技術(shù)應(yīng)用于PPO的滅活時(shí)，高強(qiáng)度瞬時(shí)條件破壞酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶失活率高，低強(qiáng)度瞬時(shí)條件能更大程度激活酶的活性以及增加次生代謝產(chǎn)物含量，在低強(qiáng)度、長時(shí)條件下，滅活酶的效果更傾向于高溫效應(yīng)，適當(dāng)與中低溫技術(shù)結(jié)合能起到協(xié)同滅酶作用。因此，應(yīng)根據(jù)不同果蔬原料以及工藝目標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)募夹g(shù)參數(shù)來抑制酶活性。

表 10 脈沖電場處理對不同來源PPO活性的影響Table 10 Effect of pulsed electric field processing on PPO activity from different sources

5.2.5 超聲處理

超聲是一種高強(qiáng)度-低頻率（10～1 000 W/cm2、20～200 kHz）的非熱技術(shù)，應(yīng)用在食品領(lǐng)域能最大限度地減少感官、營養(yǎng)和抗氧化能力的損失。表11總結(jié)了超聲處理對不同來源PPO影響的部分研究。在一級失活動力學(xué)條件下，隨著超聲強(qiáng)度的增加和處理時(shí)間的延長，楊梅汁PPO活性顯著降低;在90、181 W/cm2功率密度下超聲10 min，PPO活力分別降低了53.23%和12.84%;在271、362 W/cm2處理下，PPO活力僅殘留4.22%和0.08%[119]。相似的PPO失活動力學(xué)模型在蘑菇、梨、草莓、蘋果中[120-121]也有體現(xiàn)。低功率下超聲處理能促進(jìn)酶的激活，菠蘿汁經(jīng)超聲150～300 W/cm2處理，酶活性隨功率密度的增加而增加，處理時(shí)間在4～5 min時(shí)表現(xiàn)最大殘余活性[122]。雖然高超聲功率（968 W/cm2、10 min）降低了PPO活性，提高了酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性，但草莓汁的花青素含量減少了19.91%，桑葚汁中花青素最低損失率也達(dá)到5.6%[123-124]。超聲處理引起的酶失活可歸因于不同的機(jī)制，包括超聲引起的空化作用導(dǎo)致壓力和溫度局部增加，以及強(qiáng)剪切應(yīng)力導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)的改變[125]。溫度隨著超聲頻率的增加及處理時(shí)間的延長而升高，在超聲（24 kHz、460 W/cm2、210 μm）處理15 min條件下，草莓醬的中心溫度從20 ℃增至33 ℃，在未經(jīng)控溫的超聲處理蘋果汁時(shí)溫度隨時(shí)間延長呈線性增加，在7 min內(nèi)溫度從7 ℃升高至78 ℃[126-127]。一定程度上，溫度的升高對超聲滅酶處理有輔助作用，在不控制溫度情況下，超聲聯(lián)合熱處理與常規(guī)巴氏殺菌相比，有更好的殺菌和滅酶效果。然而，有研究者比較了熱（65 ℃）、高壓（600 MPa、48 ℃）、超聲（24 kHz、1.3 W/g、33 ℃）處理對草莓醬滅酶耗能情況，在滅酶效果相近（剩余11%～18%活力）時(shí)，所需能量分別為240、291、1 233 kJ/kg，說明在同等效應(yīng)下超聲反應(yīng)器的設(shè)計(jì)還需克服耗能高的問題[126]。PPO的抗性不僅受加工條件的影響，還與酶源有關(guān)。Sulaiman等[126]研究超聲波和熱處理對不同果泥酶促褐變的控制效果，結(jié)果表明梨PPO的抗性強(qiáng)于蘋果和草莓。超聲單獨(dú)應(yīng)用于抑制酶活性的效果不太顯著，因此它主要聯(lián)合熱處理使用，在黃花菜中利用低頻（40 kHz）和低密度（低于1 W/cm2）超聲結(jié)合熱（高于60 ℃）作為預(yù)處理以使酶活性喪失，可提高顏色質(zhì)量并減少干燥黃花菜的營養(yǎng)損失[128]。

表 11 超聲處理對不同來源PPO活性的影響Table 11 Effect of ultrasound processing on PPO activity from different sources

5.2.6 紫外輻射處理

紫外光根據(jù)波長可分為UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）、UV-C（100～280 nm）3 種類型。有研究表明在波長250～280 nm之間紫外線會改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)，使微生物無法繁殖，因此UV-C輻射常用于食品領(lǐng)域的殺菌處理[129]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射對酶促褐變也有一定影響，Lante等[130]提出這可能與氨基酸殘基（Trp、Tyr、His、Phe、Met、Cys）吸收光而引起的直接光氧化、蛋白質(zhì)變性和高分子質(zhì)量聚集體的形成有關(guān)。表12總結(jié)了部分研究近況。Al-Qurashi等[131]研究了不同功率密度（0.9～4.9 W/m2）對葡萄品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，微生物數(shù)量減少，但PPO活性顯著增加。另一研究用UV-C對蘋果PPO酶液進(jìn)行處理，經(jīng)13.8 W/m2輻照33 min后，酶活力下降至原來的10%以下;但將UV-C直接應(yīng)用于蘋果汁時(shí)，在更高的輻照強(qiáng)度21.9 W/m2處理100 min下，相對酶活力仍大于20%，且果汁顏色發(fā)生明顯褐變，這可能與果汁的低UV-C透光率和酚類物質(zhì)的直接光氧化有關(guān)[132]。Sampedro等[133]研究了pH值對蘑菇中PPO活性的影響，發(fā)現(xiàn)將低溫與紫外聯(lián)合（60 ℃、58.2 mJ/cm2）處理5 min，任何pH值處理下均能使PPO完全滅活，且在酸性條件下失活更容易。一些研究表明UV-C輻照對食物可能造成不良影響，如顏色變化、抗氧化能力降低、形成潛在致癌物呋喃[134]。因此，一些研究者也探究了其他紫外波長處理對PPO的影響，經(jīng)UV-A（波長390 nm、輻照強(qiáng)度2.43×10-3W/m2）處理鮮切蘋果60 min后，與對照組相比其色差減少的百分比%RΔE（用于衡量抗褐變的能力）為60%，褐變控制效果顯著[134]。不同來源的PPO抗性不同，在相同條件下（（25±1）℃、輻照功率400 W），蘋果汁PPO在100 min后完全失活，白葡萄汁PPO在140 min后仍保留20%活力，粉葡萄汁PPO僅失活50%[135]?？傮w來說，紫外輻射較其他物理滅酶技術(shù)效果弱，但聯(lián)合低溫技術(shù)能大大提高其效率，此外紫外輻射能同時(shí)滅菌與滅酶，未來應(yīng)該具有較大發(fā)展前景。

表 12 紫外輻射處理對不同來源PPO活性的影響Table 12 Effect of UV radiation on PPO activity from different sources

6 結(jié) 語

PPO引起的褐變反應(yīng)對果蔬工業(yè)造成了巨大損失，受到廣泛關(guān)注，研究者從化學(xué)、物理、生物角度對其進(jìn)行了探究，但仍存在很多未解決的問題。

首先，多種現(xiàn)象表明PPO與植物抵御外界脅迫、光合作用、生物合成等相關(guān)，但其中關(guān)聯(lián)機(jī)制并未解開。另外，PPO基因家族較復(fù)雜，物種間編碼基因也存在差異。因此，從基因敲除或基因沉默上對PPO進(jìn)行控制變得困難，研究也較少。目前有學(xué)者對馬鈴薯PPO基因進(jìn)行反義表達(dá)及人工microRNA手段調(diào)控[140-141]，可從基因?qū)用嬲{(diào)控馬鈴薯褐變問題，但是對這種馬鈴薯的等效性評價(jià)還有待考證。未來在該領(lǐng)域的研究可能會逐漸從糧食作物（馬鈴薯）延伸至日常果蔬作物，并且采用基因敲除、基因沉默或基因編輯的手段研究PPO，可厘清PPO基因參與調(diào)控褐變和生理功能的關(guān)系。

其次，隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)不斷完善，對PPO的分離純化研究也越來越多，不同來源的PPO被分離出來，酶學(xué)性質(zhì)也被廣泛研究?；诿笇W(xué)性質(zhì)，許多控制手段被提出，如酸化劑、螯合劑、競爭性抑制劑、熱水漂燙、蒸汽漂燙等。但這些方法的弊端，如營養(yǎng)損失、不安全等問題也顯現(xiàn)。新的、更溫和的方法逐步發(fā)展，如脈沖電場、超聲處理、超高壓處理、紫外輻射處理等，通常這些非熱物理方法同時(shí)具有殺菌和滅酶的效果，但不同酶源的抗性不同，物理作用引起酶結(jié)構(gòu)變化還可能引起潛在酶激活，因此非熱物理手段常作為一種輔助滅酶技術(shù)使用。今后，實(shí)現(xiàn)非熱物理手段滅酶還需克服酶激活、高成本及高能耗問題。

最后，1998年Klabunde等[3]對兒茶酚氧化酶結(jié)構(gòu)模型及活性中心的提出促進(jìn)了分子水平上構(gòu)效關(guān)系模型的研究。隨后Gerdemann等[18]在前人的研究基礎(chǔ)上提出了酶促褐變反應(yīng)機(jī)理，為褐變控制研究明確了方向，可從氧氣濃度、酶活性、褐變反應(yīng)過程、底物4 個(gè)方面進(jìn)行控制。目前廣泛研究的主要是對前3 個(gè)方面，包括隔氧、控氧、抑制醌的聚合及調(diào)節(jié)醌的還原、破壞酶適應(yīng)環(huán)境等。實(shí)際上，從氧氣濃度和褐變反應(yīng)過程控制褐變具有一定延時(shí)性，從酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)方面對控制褐變會更直接有效。但由于PPO分離純化及結(jié)晶難度大，且其在細(xì)胞中廣泛存在并以不同形式存在等原因，其高級結(jié)構(gòu)至今仍未解開。目前對結(jié)構(gòu)的研究主要從核酸序列、蛋白質(zhì)序列出發(fā)，用軟件模擬其空間結(jié)構(gòu)、活性中心、底物結(jié)合區(qū)等，再根據(jù)PPO結(jié)構(gòu)信息，用計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)篩選新型抑制劑。但是，這些研究均建立于模擬結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，PPO的真實(shí)結(jié)構(gòu)還未被解開。近年，冷凍電子顯微鏡技術(shù)已應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)解析研究，目前在生物醫(yī)學(xué)方面研究較多，在未來若能成功應(yīng)用于PPO結(jié)構(gòu)的解析將有助于為褐變控制研究開拓新方向。