葛凌 陳何健 徐航娣

[摘要] 目的 探究miR-501在吉非替尼耐藥非小細胞肺癌（NSCLC）中的作用和機制。 方法 采用實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測吉非替尼耐藥性NSCLC血清和細胞系PC9/GR中miR-501的表達水平，通過CCK-8、劃痕實驗和Transwell實驗檢測miR-501對PC9/GR的惡性表型的影響;利用在線數(shù)據(jù)庫預測miR-501的潛在靶點，并驗證其在PC9/GR的具體作用。 結(jié)果 與健康對照人群和正常人肺上皮細胞系比較，miR-501在吉非替尼耐藥性NSCLC患者血清和PC9/GR中表達水平升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;與mimics NC比較，miR-501 mimics PC9/GR的增殖、遷移和侵襲能力增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實BLID是miR-501的直接靶點;與miR-501 mimics+pcDNA3.1比較，miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID PC9/GR的增殖、遷移和侵襲能力下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結(jié)論 上調(diào)表達的miR-501通過抑制BLID進而促進吉非替尼耐藥性NSCLC的增殖、遷移和侵襲能力。因此，miR-501是吉非替尼耐藥性NSCLC的潛在靶點。

[關(guān)鍵詞] 非小細胞肺癌;miR-501;吉非替尼耐藥;BLID

[中圖分類號] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0018-06

The malignant phenotype of gefitini-resistant non-small cell lung cancer mediated by miR-501 targeted BLID

GE Ling1 ? CHEN Hejian2 ? XU Hangdi3

1.Department of Pharmacy， Zhuji Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Zhuji ? 311800， China; 2.Department of Respiratory Medicine， Zhuji Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Zhuji ? 311800， China; 3.Medical College of Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou ? 310058， China

[Abstract] Objective To explore the role of miR-501 in non-small cell lung cancer （NSCLC） with gefitinib resistance and its underlying mechanism. Methods The expression of miR-501 in NSCLC with gefitinib resistance serum and PC9/GR were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The effect of miR-501 on the malignant phenotype of PC9/GR was detected by CCK-8， scratch test and Transwell test. The online database was used to predict the potential target of miR-501 and to verify its specific role in PC9/GR. Results Compared with the healthy control people and the normal lung epithelial cell lines， the expression level of miR-501 in gefitini-resistant NSCLC ?patients serum and PC9/GR were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the mimics NC， the proliferation， migration and invasion capacity of PC9/GR in the miR-501 mimics were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The luciferase reporter assay confirmed that BLID was a direct target for miR-501. Compared with the miR-501 mimics+pcDNA3.1， the proliferation， migration and invasion of PC9/GR in the miR-501 mimics+ pcdna3.1-blid were decreased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion The upregulation of miR-501 promoted the proliferation， migration， and invasion of geffitini-resistant NSCLC by inhibiting BLID. Therefore， miR-501 is a potential target for gefitinib-resistant NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer; miR-501; Gefitinib resistance; BLID

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)位居第一[1]。在病理分類中，肺癌的主要亞型是非小細胞肺癌（NSCLC）。目前，多種治療方式均可用于臨床治療NSCLC。分子靶向藥吉非替尼的出現(xiàn)為一部分NSCLC患者帶來更好的臨床收益[2-3]。有研究顯示[4]，大多數(shù)接受吉非替尼治療的NSCLC患者會出現(xiàn)耐藥性。微小RNA（miRNAs）是一類存在于生物體的非編碼RNA分子，其長度為21～25個核苷酸，通過結(jié)合mRNAs的3′端非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)蛋白表達，進而在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用[5-6]。miR-501是定位于X染色體的miRNA分子，介導胃癌對化療藥物阿霉素的耐藥性產(chǎn)生，并且與BLID的抑制表達相關(guān)[7]。在結(jié)直腸癌中，miR-501介導五氟尿嘧啶耐藥性腫瘤細胞的增殖[8]。這些研究均提示，miR-501在腫瘤耐藥性中扮演重要角色。近期的一項研究顯示[9]，miR-501在肺腺癌中顯著高表達。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，BLID在NSCLC中顯著低表達。基于以上發(fā)現(xiàn)，本研究推測miR-501可能在吉非替尼耐藥性NSCLC中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1～10月就診于溫州醫(yī)科大學附屬諸暨醫(yī)院（以下簡稱“我院”）初診NSCLC患者6例為初診NSCLC組和吉非替尼耐藥性NSCLC患者6例為吉非替尼耐藥性NSCLC組，同期健康體檢者6名為健康對照組。三組性別、年齡、體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性，見表1。受試對象均被告知本試驗的研究目的，并簽署知情同意書。涉及的操作經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

表1 ? 三組一般資料比較

1.2 細胞系

正常人肺上皮細胞系BEAS-2B、人NSCLC細胞系PC9和人胚胎腎細胞系HEK-293T均購于美國ATCC公司;吉非替尼耐藥性PC9細胞系PC9/GR由PC9細胞系構(gòu)建，保存于溫州醫(yī)科大學科研實驗中心。

1.3 試劑與儀器

胎牛血清FBS（貨號：10099）、RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號：12633012）和DMEM培養(yǎng)基（貨號：12491015）購于美國Gibco;miRNeasy Serum/Plasma試劑盒（貨號：217184）和miRNeasy Mini試劑盒（貨號：217004）購于德國Qiagen;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（貨號：DRR081A）購于日本Takara;引物、miR-501 mimics、BLID過表達質(zhì)粒、載有野生型BLID和突變型BLID的載體pGL3購于中國生工;Lipofectamine 3000（貨號：L3000015）購于美國Invitrogen;吉非替尼（貨號：SML1 657）購于美國Sigma-Aldrich;CCK-8試劑盒（貨號：C0038）、RIPA裂解液（貨號：P0013B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（貨號：P0012A）、小鼠抗GAPDH單克隆抗體（貨號：AF0006）和辣根過氧化物酶耦合二抗（貨號：A0208、A0216）購于中國碧云天;Transwell小室（貨號：354480）購于美國CORNING;PVDF膜（貨號：IPVH00010）購于美國Millipore;兔抗BLID多克隆抗體（貨號：ab230129）購于美國Abcam;熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：G7940）購于美國Promega;倒置顯微鏡（IXplore Standard）購于日本奧林巴斯;實時定量PCR儀（CFX384 TouchTM）、電泳轉(zhuǎn)膜儀（Mini-PROTEAN？誖 Tetra Cell）、化學發(fā)光儀（ChemiDoc XRS+）和酶標儀（iMark）購于美國Bio-Rad。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) ?PC9、PC9/GR和HEK-293T培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，BEAS-2B培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，隔天換液，在5% CO2、37℃條件下進行培養(yǎng)，當細胞密度達到80%時進行傳代。

1.4.2 PC9/GR構(gòu)建和分組 ?處于對數(shù)生長期的PC9加入含有吉非替尼的培養(yǎng)基，濃度從100 nmol/L開始，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基和漂浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。當耐藥細胞在不含吉非替尼的培養(yǎng)基生長至對數(shù)期，提高吉非替尼濃度，反復誘導，直至細胞在1 μmol/L吉非替尼下穩(wěn)定生長，即得到實驗所用PC9/GR。實驗分組：①miR-501 mimics+gefitinib組和mimics NC+gefitinib組;②共轉(zhuǎn)染野生型BLID和mimics NC組和共轉(zhuǎn)染野生型BLID和miR-501 mimics組;③pcDNA3.1-BLID組和pcDNA3.1組;④miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib組和miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib組。

1.4.3 實時熒光定量PCR ?血清miRNA的提取用miRNeasy Serum/Plasma試劑盒，細胞miRNA用miR-Neasy Mini試劑盒提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量，程序設(shè)定為95℃、10 min，然后40個循環(huán)為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s。U6作為微小RNA內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達。hsa-miR-501：正義鏈5′-CTGCTCTGCTCGTCCTCTCT-3′，反義鏈5′-CTCCTGTCCTCACATGAAGA-3′。U6：正義鏈5′-AGGGG-CCATCCACAGTCTTC-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4.4 細胞活力測定 ?PC9和PC9/GR接種于96孔板，每孔細胞數(shù)約8000個，用含有1 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在4、24、48 h和72 h測定OD值。將PC9/GR接種于96孔板，每孔細胞數(shù)約為6000個，將miR-501 mimics（1.5 μL）、BLID過表達質(zhì)粒（1.5 μL），利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至PC9/GR培養(yǎng)48 h，然后更換培養(yǎng)基，在4、24、48 h和72 h測定OD值。本研究中，每孔100 μL培養(yǎng)基加入10 μL的CCK-8反應液，培養(yǎng)2 h后于酶標儀測定，波長設(shè)定450 nm。miR-501 mimics序列：5′-AGAAUCCUUGCCCGGGUGCAUU-3′。陰性對照mimics NC序列：5′-GUCGGUUCGCAUACUCACUGGA-3′。

1.4.5 細胞劃痕實驗 ?將轉(zhuǎn)染了miR-501 mimics、pcDNA3.1-BLID的PC9/GR接種于6孔板，每孔細胞數(shù)密度約為2.5×105個，過夜培養(yǎng)后，用移液管尖端進行劃痕，用無菌PBS輕輕洗去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，24 h后進行拍照。

1.4.6 Transwell實驗 ?將轉(zhuǎn)染了miR-501 mimics、pcDNA3.1-BLID的PC9/GR在無血清的培養(yǎng)基重懸，Transwell小室的上室接種約2×105個細胞，Transwell小室的下室倒入含血清的培養(yǎng)基。在細胞孵箱培養(yǎng)24 h后，用甲醇固定下室細胞，并用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，然后在倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。

1.4.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒??熒光素酶報告基因?qū)嶒炘贖EK-293T中進行。HEK-293T接種于96孔板，約8000個/孔，將載有野生型BLID的pGL3（1.5 μL）與miR-501 mimics（1.5 μL）、載有突變型BLID的pGL3（1.5 μL）與miR-501 mimics（1.5 μL）、載有野生型BLID的pGL3（1.5 μL）與mimics NC（1.5 μL）、載有突變型BLID的pGL3（1.5 μL）與mimics NC（1.5 μL）分別利用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染至HEK-293T內(nèi)，48 h后用Bio-GloTM Luciferase Assay System檢測，分析數(shù)值。

1.4.8 蛋白免疫印跡實驗 ?收集PC9/GR，用RIPA裂解，BCA法蛋白濃度定量;蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜;PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h;抗BLID和GAPDH一抗在-4℃過夜孵育;TBST洗膜后，用辣根過氧化物酶耦合的二抗在室溫孵育PVDF膜2 h;ChemDocTM XRS+ System儀器檢測目的條帶，并用Image Lab軟件進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較用非參數(shù)t檢驗，多組數(shù)據(jù)分析使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-501的表達水平

與健康對照組比較，初診NSCLC組、吉非替尼耐藥性NSCLC組血清miR-501表達水平升高（P < 0.01），且吉非替尼耐藥性NSCLC組血清miR-501表達水平高于初診NSCLC組（P < 0.05）（圖1A）。此外，qRT-PCR檢測細胞系顯示，PC9和PC9/GR的miR-501表達水平高于BEAS-2B（P < 0.01），且PC9/GR的miR-501表達水平高于PC9（P < 0.01）（圖1B）。

A：miR-501在NSCLC患者和健康對照血清中的表達;B：miR-501在NSCLC細胞系PC9和人正常肺上皮細胞系BEAS-2B的表達。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。NSCLC：非小細肺癌

圖1 ? miR-501在吉非替尼耐藥性NSCLC的表達

2.2 miR-501在PC9/GR中的作用

與4 h比較，PC9/GR正常生長，而PC9的增殖能力明顯降低（P < 0.01）（圖2A）。miR-501 mimics+gefitinib組PC9/GR增殖能力高于mimics NC+gefitinib組（P < 0.01）（圖2B）。miR-501 mimics+gefitinib組細胞遷移能力高于mimics NC+gefitinib組（P < 0.01）（圖2C）。Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-501 mimics+gefitinib組細胞侵襲能力高于mimics NC+gefitinib組（P < 0.01）（圖2D）。

2.3 miR-501的靶點鑒定

與mimics NC組比較，共轉(zhuǎn)染野生型BLID和miR-501 mimics組的熒光素酶活性顯著減低（P < 0.01）（圖3A）。miR-501 mimics組PC9/GR的BLID蛋白表達水平低于mimics NC組（P < 0.01）（圖3B）。

2.4 miR-501/BLID軸在PC9/GR中的作用

將BLID過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC9/GR，pcDNA3.1-BLID組BLID的蛋白表達水平顯著高于pcDNA3.1組（P < 0.01）（圖4A）。miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib組的細胞活力低于miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib組（P < 0.01）（圖3B）。miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib組PC9/GR的遷移能力和侵襲能力均低于miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib組（P < 0.05或P < 0.01）（圖4C～D）。

3 討論

肺癌是腫瘤相關(guān)性致死的主要惡性疾病，80%～85%的肺癌屬于NSCLC[11]。研究發(fā)現(xiàn)20%～40%NSCLC患者存在表皮生長因子受體（EGFR）突變[12]。分子靶向藥物吉非替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，與EGFR的ATP結(jié)合位點競爭性結(jié)合，用于攜有EGFR突變的NSCLC患者[13]。然而，臨床使用發(fā)現(xiàn)，接受吉非替尼治療的NSCLC患者在中位治療期約10個月后會產(chǎn)生對吉非替尼的耐藥性，導致治療失敗[4]。因此，尋找NSCLC吉非替尼耐藥靶點有助于為臨床治療NSCLC提供更好的策略。

大量研究證實，miRNAs在NSCLC的耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-135a誘導促細胞增殖相關(guān)蛋白RAC1上調(diào)介導NSCLC細胞的吉非替尼耐藥性。臨床樣本結(jié)果提示，攜有EGFR突變的NSCLC血清出現(xiàn)miR-214表達顯著增高;進一步的細胞學實驗結(jié)果顯示，下調(diào)miR-214可抑制厄洛替尼耐藥性NSCLC細胞的遷移和侵襲能力，增加其對厄洛替尼的敏感性[15]。這些研究提示，miRNAs具有促進NSCLC耐藥性產(chǎn)生的作用。此外，抑制miR-873可促進NSCLC細胞的吉非替尼耐藥性[16]。與之類似的是，沉默miR-483-3p的表達誘導EGFR突變型NSCLC細胞出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并降低腫瘤細胞對吉非替尼的敏感性[17]，提示不同miRNAs分子在NSCLC的耐藥性產(chǎn)生中扮演相反的角色。本研究結(jié)果提示，miR-501在吉非替尼耐藥性NSCLC患者和細胞系中均出現(xiàn)上調(diào)表達。離體實驗明確miR-501抑制BLID的表達，進而促進PC9/GR細胞增殖、遷移和侵襲能力。

BLID是凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族分子，在多種腫瘤組織中顯著低表達，并參與腫瘤耐藥性。在乳腺癌和卵巢癌中，BLID的缺失表達介導腫瘤細胞對PARP抑制劑的耐藥性[18]。Goldsmith等[19]研究證實，下調(diào)表達的BLID與神經(jīng)母細胞瘤的治療反應和耐藥性相關(guān)。另有研究顯示[20]，miR-501在阿霉素耐藥的胃癌組織和細胞中高表達，通過抑制BLID的表達介導阿霉素的耐藥性。該課題組進一步實驗明確，miR-501主要來源于阿霉素耐藥性胃癌細胞的外泌體[7]。本研究結(jié)果與其類似，并發(fā)現(xiàn)在PC9/GR細胞中轉(zhuǎn)染BLID過表達質(zhì)粒可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性生物學行為。

綜上，miR-501具有促進吉非替尼耐藥性NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的作用，而且其作用與抑制BLID表達有關(guān)。因此，這些結(jié)果初步提示miR-501/BLID軸促進吉非替尼耐藥性NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力，而抑制miR-501可能有助于阻斷吉非替尼耐藥性NSCLC的進展。

[參考文獻]

[1] ?Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2] ?Lee CK，Brown C，Gralla RJ，et al. Impact of EGFR inhibitor in non-small cell lung cancer on progression-free and overall survival：a meta-analysis [J]. J Natl Cancer Inst，2013，105（9）：595-605.

[3] ?Lee CK，Davies L，Wu YL，et al. Gefitinib or Erlotinib vs Chemotherapy for EGFR Mutation-Positive Lung Cancer： Individual Patient Data Meta-Analysis of Overall Survival [J]. J Natl Cancer Inst，2017，109（6）：djw279.

[4] ?Jackman D，Pao W，Riely GJ，et al. Clinical definition of acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-small-cell lung cancer [J]. J Clin Oncol，2010，28（2）：357-360.

[5] ?Lu TX，Rothenberg ME. MicroRNA [J]. J Allergy Clin Immunol，2018，141（4）：1202-1207.

[6] ?Rupaimoole R，Slack FJ. MicroRNA therapeutics： towards a new era for the management of cancer and other diseases [J]. Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：203-222.

[7] ?Liu X，Lu Y，Xu Y，et al. Exosomal transfer of miR-501 confers doxorubicin resistance and tumorigenesis via targeting of BLID in gastric cancer [J]. Cancer Lett，2019， 459（1）：122-134.

[8] ?Pan R，Cai W，Sun J，et al. Inhibition of KHSRP sensitizes colorectal cancer to 5-fluoruracil through miR-501-5p-mediated ERRFI1 mRNA degradation [J]. J Cell Physiol，2019，235（2）：1576-1587.

[9] ?Chen S，Zhou YC，Chen Y，et al. Expression profile of miR-501-5p in lung adenocarcinoma patients from Xuanwei area [J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2017，37（3）：354-359.

[10] ?Wang H，Yan C，Shi X，et al. MicroRNA-575 targets BLID to promote growth and invasion of non-small cell lung cancer cells [J]. FEBS Lett，2015，589（7）：805-811.

[11] ?Travis WD. The 2015 WHO classification of lung tumors [J]. Pathologe，2014，35（2）：188.

[12] ?Zhang YL，Yuan JQ，Wang KF，et al. The prevalence of EGFR mutation in patients with non-small cell lung cancer： a systematic review and meta-analysis [J]. Oncotarget，2016，7（48）：78985-78993.

[13] ?Ning J，Wu Q，Liu Z，et al. Mapping inhibitor response to the in-frame deletions，insertions and duplications of epidermal growth factor receptor （EGFR） in non-small cell lung cancer [J]. J Recept Signal Transduct Res，2016， 36（1）：37-44.

[14] ?Zhang T，Wang N. miR-135a Confers Resistance to Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer Cells by Upregulation of RAC1 [J]. Oncol Res，2018，26（8）：1191-1200.

[15] ?Liao J，Lin J，Lin D，et al. Down-regulation of miR-214 reverses erlotinib resistance in non-small-cell lung cancer through up-regulation LHX6 expression [J]. Sci Rep，2017，7（1）：781.

[16] ?Jin S，He J，Li J，et al. MiR-873 inhibition enhances gefitinib resistance in non-small cell lung cancer cells by targeting glioma-associated oncogene homolog 1 [J]. Thorac Cancer，2018，9（10）：1262-1270.

[17] ?Yue J，Lv D，Wang C，et al. Epigenetic silencing of miR-483-3p promotes acquired gefitinib resistance and EMT in EGFR-mutant NSCLC by targeting integrin beta3 [J]. Oncogene，2018，37（31）：4300-4312.

[18] ?Issaeva N，Thomas HD，Djureinovic T，et al. 6-thioguanine selectively kills BRCA2-defective tumors and overcomes PARP inhibitor resistance [J]. Cancer Res，2010， 70（15）：6268-6276.

[19] ?Goldsmith KC，Gross M，Peirce S，et al. Mitochondrial Bcl-2 family dynamics define therapy response and resistance in neuroblastoma [J]. Cancer Res，2012，72（10）：2565-2577.

[20] ?Xu YC，Liu X，Li M，et al. A Novel Mechanism of Doxorubicin Resistance and Tumorigenesis Mediated by MicroRNA-501-5p-Suppressed BLID [J]. Mol Ther Nucleic Acids，2018，12（1）：578-590.

（收稿日期：2019-12-13 ?本文編輯：劉永巧）