依據(jù)COI基因及形態(tài)特征鑒定蛀害紅松和樟子松的梢斑螟1)

盧孟 解丹 宋效惠 遲德富

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

赤松梢斑螟(Dioryctriasylvestrella)是危害針葉樹種的重要鉆蛀性害蟲，其主要寄主植物為紅松(Pinuskoraiensis)，在球果、枝梢及樹干中均有發(fā)現(xiàn)[1-3]。除此之外，在藏東南地區(qū)赤松梢斑螟也會(huì)危害高山松(P.densata)[4]。近10年來，在黑龍江省、吉林省樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)和紅松枝干大量受到梢斑螟屬害蟲的危害，使大量的樟子松折枝、斷頭、枯萎、死亡。僅在齊齊哈爾地區(qū)發(fā)生面積就超過1.3萬hm2，危害重的林分樟子松受害率達(dá)到100%，斷頭枯死樹在30%以上。在加格達(dá)奇樟子松種子園危害面積達(dá)到270 hm2。在黑龍江省撫遠(yuǎn)縣、勃利縣和樺南縣等地也有大面積樟子松和紅松被害?，F(xiàn)有研究認(rèn)為危害樟子松的梢斑螟屬(Dioryctria)害蟲主要為樟子松梢斑螟(D.mongolicella)，在樹干、側(cè)枝的韌皮部與木質(zhì)部之間蛀食為害[5-6]，并認(rèn)為該害蟲發(fā)育不整齊世代嚴(yán)重重疊，以各齡幼蟲在枝干越冬，從每年的春季到秋季均能在枝干的被害處發(fā)現(xiàn)幼蟲和蛹，同時(shí)在野外發(fā)現(xiàn)成蟲。尚未見赤松梢斑螟危害樟子松的報(bào)道。通過前期觀察發(fā)現(xiàn)，在勃利地區(qū)危害紅松樹干及側(cè)枝的梢斑螟屬幼蟲，與加格達(dá)奇、齊齊哈爾地區(qū)危害樟子松的幼蟲外部形態(tài)相似，其為害狀也相同，均會(huì)在被害處形成摻有顆粒狀排泄物的凝脂團(tuán)。確切鑒定種類是有效控制害蟲危害的根本前提，為確定危害樟子松和紅松枝干的害蟲的具體種類，本研究將通過形態(tài)特征及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。

核苷酸序列，特別是線粒體DNA(mtDNA)序列已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物種界定[7-8]。隨著Hebert et al.[9]提出DNA條形碼的概念以來，COI基因逐漸成為物種分類研究的重要分子標(biāo)記手段。近些年來，基于COI基因?qū)ι野呙鴮傧到y(tǒng)發(fā)育的研究較多：于瀟翡等[10]分析了華北地區(qū)4種梢斑螟遺傳分化；Roe et al.[11]用COI基因序列對180個(gè)梢斑螟樣本進(jìn)行鑒定，區(qū)分出8個(gè)種。這些研究證明了利用COI基因鑒別不同梢斑螟種類及劃定物種界限的有效性，因此本研究將基于COI基因確定待鑒別物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用于輔助鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于黑龍江地區(qū)紅松林及樟子松林內(nèi)采集活體幼蟲，采集信息詳見表1。采集結(jié)束后將部分幼蟲固定于體積分?jǐn)?shù)95%的酒精中，用于觀察其毛序，并進(jìn)行基因組提??；其余幼蟲通過室內(nèi)飼養(yǎng)獲得成蟲，以進(jìn)行外部形態(tài)及外生殖器鑒定。幼蟲毛位圖的繪制參考陸近仁等[12]及朱弘復(fù)[13]。

表1 黑龍江地區(qū)梢斑螟屬幼蟲采集信息

1.2 目的基因的提取與擴(kuò)增

基因組的提取參考Roe et al.[11，14-15]所用樣本容量，每個(gè)種群選取10只待測樣本。使用天根DNA提取試劑盒(DP304)，并參照試劑盒中提供的方法從樣本中提取總DNA。使用通用引物對線粒體COI基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物L(fēng)CO1490，5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；下游引物HCO2198，5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[16]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中DNA模板1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、PremixTaq酶25 μL以及20 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序根據(jù)Du et al.[17]調(diào)整，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸7 min。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗(yàn)證目的條帶，后委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序，測序引物同擴(kuò)增引物。為保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用正反雙向測序。

除采自黑龍江地區(qū)的梢斑螟種類外，其余物種的COI基因序列均來自于GeneBank。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果用DNAstar v7.1軟件包中SeqMan程序進(jìn)行拼接和校正，并去除序列兩端引物部分。利用Primer Premier 5軟件翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比對，確定密碼子起始位置。

使用MEGA v7.0軟件進(jìn)行多重序列比對，計(jì)算DNA序列的堿基組成、突變位點(diǎn)，并進(jìn)行堿基替換分析、遺傳距離分析和系統(tǒng)發(fā)育分析[18]。其中，遺傳距離選用Kimura 2-Parameter模型進(jìn)行計(jì)算。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)，通過1 000次自舉運(yùn)算進(jìn)行檢驗(yàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度以自舉值表示[19]。NJ樹選用p-distance模型，ML樹選用GTR+G+I模型。通過DAMBE v5軟件進(jìn)行堿基替代飽和度檢驗(yàn)[20]。利用DnaSP v6軟件統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目及頻率[21]，保留不同的單倍型上傳至GeneBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征比對

用于鑒定的樣本具有相同的形態(tài)特征。

成蟲(圖1a)：雌雄同型，體長12～16 mm，翅展28～32 mm，觸角鋸齒狀。頭部及前胸黑褐色，腹部灰褐色。前翅斑紋明顯，內(nèi)橫線、中橫線及外橫線灰白色。內(nèi)橫線向基部形成1個(gè)三角形尖突；中橫線波浪狀，向外緣形成3個(gè)弧形突；外橫線曲折，向基部形成2個(gè)尖突，向外緣形成1個(gè)尖突。中橫線與外橫線之間有1灰白色腎形斑。亞基線灰白色，中橫線到基橫線之間靠近后緣部分為黃褐色，并被內(nèi)橫線分割。亞外緣線灰白色，摻雜黑色鱗片，外緣黑色。后翅灰褐色，外緣顏色較深。前、后翅緣毛均為灰褐色。

外生殖器(圖1b-e)：雄性外生殖器爪形突頂端鈍圓，顎形突兩側(cè)寬臂呈弓狀與背兜相連。抱器背呈闊鐮刀狀，抱器端伸出短尖突彎曲如鉤，抱器背一側(cè)有縱向褶。背兜呈倒V字形。陽莖端環(huán)圓形，伸出兩臂與背兜相連。基腹弧狹長，端部收縮且棱角明顯。雌性外生殖器囊導(dǎo)管有縱向褶皺，基部稍寬，交配囊內(nèi)有大量細(xì)刺。

幼蟲(圖2)：頭部黑褐色，前胸背板黑色發(fā)亮，體表灰黑色。第1胸節(jié)前胸氣門盾較大，包圍氣門約四分之一；毛片中部上下排列2根剛毛，上側(cè)剛毛較短。第2胸節(jié)及第8腹節(jié)亞背毛毛片上有一淺色圓斑。第9腹節(jié)亞背毛2個(gè)毛片相連或稍有分離，側(cè)毛群位于同一毛片。腹足趾鉤雙序環(huán)式，臀足趾鉤雙序缺環(huán)式。

2.2 序列分析

測得樣本的COI基因序列30條，經(jīng)比對、剪切后序列長度為658 bp，無堿基插入、缺失突變。通過多重序列比對，發(fā)現(xiàn)7個(gè)變異位點(diǎn)，6個(gè)簡約信息位點(diǎn)，1個(gè)自裔位點(diǎn)。由表2可知，COI基因序列的A+T占總堿基數(shù)目的比例為68.8%，具有明顯的AT偏倚性。堿基替換主要發(fā)生在密碼子第3位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換數(shù)高于顛換數(shù)，符合堿基替換規(guī)律。

由表3可知，COI基因多重序列中7個(gè)變異位點(diǎn)將30條序列劃分為5個(gè)單倍型(Hap1-Hap5)。其中Hap3為共享單倍型，在勃利和齊齊哈爾地區(qū)均有出現(xiàn)，且所占比例較高。除Hap3外，其他單倍型均為各地理種群獨(dú)享單倍型。

表2 COI基因序列堿基組成與替換

注：R表示轉(zhuǎn)換位點(diǎn)與顛換位點(diǎn)的比值，當(dāng)顛換位點(diǎn)為0時(shí)無法計(jì)算，記為nc。

表3 不同梢斑螟的COI基因單倍型及GeneBank登錄號(hào)

注：*來自于GeneBank的COI基因序列。

2.3 遺傳距離

結(jié)合樣本序列，從GeneBank上下載4種梢斑螟COI基因的5條序列(Hap6-Hap10)作為內(nèi)群，以及1條目紋櫛角斑螟(Ceroprepesophthalmicella)COI基因序列(Hap11)作為外群，見表3。其中，赤松梢斑螟和大梢斑螟(D.magnifica)均屬于赤松梢斑螟種團(tuán)(Sylvestrellagroup)；目紋櫛角斑螟與梢斑螟同科不同屬，適合作為外群進(jìn)行相關(guān)分析。

根據(jù)表4可知，已知物種間的遺傳距離(0.044～0.130)均大于種內(nèi)遺傳距離(0～0.005)。待鑒定物種與赤松梢斑螟間的遺傳距離最小(0.004)，處于種內(nèi)遺傳距離范圍，與其他梢斑螟種類間的遺傳距離(0.045～0.096)處于種間遺傳距離范圍。其中，赤松梢斑螟和大梢斑螟之間的遺傳距離(0.044)明顯小于與云杉梢斑螟(D.schuetzeella)之間的遺傳距離(0.093～0.094)。更大的種間遺傳距離(0.116～0.130)則來自于內(nèi)群與外群之間。

表4 不同種類梢斑螟及外群種內(nèi)、種間遺傳距離

注：*外群。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育

通過堿基替代飽和度檢驗(yàn)得：Iss(0.069 2)

3 結(jié)論與討論

3.1 鑒定結(jié)果

成蟲前翅斑紋明顯，有3條波紋狀橫帶，中室端有一腎形斑；雄性外生殖器抱器背闊鐮刀狀，有縱向褶，抱器端伸出短尖突彎曲如鉤；與王平遠(yuǎn)等[22-23]對赤松梢斑螟的描述一致。又與Piao et al.[24]描述的赤松梢斑螟幼蟲進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所采幼蟲的毛序與之相同：第1胸節(jié)前胸氣門盾較大，中部上下排列2根剛毛；第9腹節(jié)亞背毛2個(gè)毛片相連或稍有分離。在不同寄主上獲得的樣本，其外部形態(tài)、外生殖器及幼蟲毛序未見明顯差別，因此形態(tài)特征的鑒定結(jié)果均為赤松梢斑螟。

樣本的COI基因序列間僅存在7個(gè)變異位點(diǎn)，序列相似度較高。在勃利和齊齊哈爾地區(qū)發(fā)現(xiàn)共享單倍型(Hap3)，2個(gè)種群可能存在基因交流[25]。通過遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，樣本與赤松梢斑螟間的遺傳距離(0.004)明顯處于種內(nèi)遺傳距離范圍(0～0.005)內(nèi)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，樣本與赤松梢斑螟明顯聚為一支，且相互嵌合。因此所測樣本應(yīng)為同一物種，與形態(tài)鑒定結(jié)果一致,可以認(rèn)為7月份中下旬采自齊齊哈爾和加格達(dá)奇地區(qū)、9月份初采自勃利縣的幼蟲均為赤松梢斑螟。

3.2 COI基因的有效性

通過分析堿基組成發(fā)現(xiàn)，COI基因序列的A+T占總堿基數(shù)目的比例為68.8%，具有明顯的AT偏倚性，符合昆蟲線粒體基因堿基組成特征[26]。突變堿基多發(fā)生于密碼子第三位點(diǎn)，以同義突變?yōu)橹鳎苌賹?dǎo)致氨基酸替代，突變后的基因受自然選擇壓力小，突變堿基易固定[27]。這些突變大多不能對物種進(jìn)化產(chǎn)生壓力，但卻經(jīng)歷了物種的演變過程，因此COI基因能夠作為一個(gè)標(biāo)尺對系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行衡量。

對所計(jì)算的遺傳距離進(jìn)行分組，比較種內(nèi)(0～0.005)、赤松梢斑螟種團(tuán)內(nèi)(0.044～0.045)、梢斑螟屬種團(tuán)間(0.093～0.096)遺傳距離范圍，結(jié)果與Roux-Morabito et al.[28]針對冷杉梢斑螟種團(tuán)(Abietellagroup)計(jì)算的各項(xiàng)遺傳距離范圍基本重合：種內(nèi)(0～0.011)、冷杉梢斑螟種團(tuán)內(nèi)(0.011～0.049)、梢斑螟屬種團(tuán)間(0.051～0.086)，其中用于比較的種團(tuán)親緣關(guān)系不同，所以種團(tuán)間遺傳距離范圍存在差異?？梢?，不同分類階元下的遺傳距離范圍有明顯差異，通過與不同親緣關(guān)系的已知種進(jìn)行比較，能夠快速確定未知種的分類地位。

從系統(tǒng)發(fā)育樹看，赤松梢斑螟和大梢斑螟均屬于赤松梢斑螟種團(tuán)，明顯聚為一支，云杉梢斑螟單獨(dú)一支，與傳統(tǒng)物種劃分相吻合。因此，COI基因序列適用于梢斑螟屬昆蟲的鑒定。