氨氮及氨基氮檢測方法的選擇及改進

張興同

(青島尚德生物技術有限公司實驗室，山東 青島 266000)

氨氮是以游離氨和銨離子形式存在的氮，是無機氮；氨基氮一般是指以有機自由基團形式存在的氮，大多為有機物中，比如氨基酸中的氮。甲醛滴定法和乙酰丙酮比色法[1]一般用于氨基氮的測定，納氏試劑比色法[2]通常用于氨氮的測定。

經(jīng)過理論分析與實驗驗證發(fā)現(xiàn)，如樣品未經(jīng)蒸餾等前處理過程，三種方法檢測的均為氨氮與氨基氮的總量。

1 方法的選擇

通過對檢測準確度、耗時、反應條件和試劑用量及危害四個方面的實驗和理論對比發(fā)現(xiàn)：納氏試劑比色法準確度高、批量檢測耗時少，操作簡便、靈敏度高、試劑用量少且危害小，是微生態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程檢測最合適的方法。

1.1 準確度

圖1 三種方法準確度對比

通過圖1可以看出，甲醛滴定法和納氏試劑比色法相對于乙酰丙酮法在檢測結(jié)果準確度上具有較大優(yōu)勢。

1.2 檢測耗時

表1 三種方法檢測耗時對比

由表1可以看出：檢測單一樣品三種方法檢測所需時間差距不大，而八個樣品同時檢測耗時差距明顯。此外甲醛滴定法全程無停頓時間，而比色法可以利用反應時間(10 min或15 min)做一些其它耗時較少的工作。

1.3 反應條件

表2 三種方法反應條件對比

通過表2對比可以看出納氏試劑比色法對反應條件要求較低，操作更為簡便。

1.4 有毒有害試劑種類、用量及揮發(fā)性

從表3可以看出：甲醛滴定法有害試劑用量最大，乙酰丙酮法用到兩種有毒有害試劑且沸水浴會促進揮發(fā)，故兩種方法試劑危害都較大；納氏試劑比色法有害試劑用量少，而且反應溫度低(室溫)，氯化汞溶液微量揮發(fā)，危害最小。

表3 有毒有害試劑種類、用量及揮發(fā)性

1.5 小結(jié)

對比檢測準確率、耗時、反應條件、有毒有害試劑用量及危害，可得出結(jié)論：納氏試劑比色法批量檢測耗時少，對反應條件(溫度、pH、反應時間)要求不高，試劑用量少且危小，通過補償校正減小色度與濁度的影響準確度也有了很大提高，是生產(chǎn)過程檢測最合適的方法。

2 納氏試劑比色法方法的改進

2.1 試劑的配置與貯存

2.1.1 納氏試劑的配置與貯存

國標[2]中納氏試劑有兩種配制方法：HgCl2-KI-KOH和HgI2-KI-NaOH，徐立生等對兩種方法進行了多方面的對比[3]得出結(jié)論：兩種方法均能滿足檢測需要，方法一雖然配置較為麻煩，但試劑汞含量低，在靈敏度、準確度、空白值、檢出限等方面均優(yōu)于方法二，因此從“清潔分析，節(jié)能減排”的理念出發(fā)，配置納氏試劑首選方法為HgCl2法，而HgI2法納氏試劑可用于應急檢測。

通過計算及參閱成春芳等對納氏試劑配制方法的探討[4]發(fā)現(xiàn)：方法一氯化汞和碘化鉀的加入比例應由HJ535-2009方法中為2.5∶5減少2.1∶5，攪拌溶解后，改為滴加飽和二氯化汞溶液繼續(xù)攪拌，至出現(xiàn)微量朱紅色沉淀不再溶解時，停止滴加飽和二氯化汞溶液。

納氏試劑配置過程反應如下:

(1)HgCl2+2KI=HgI2↓(紅色)+2KCl

(2)HgI2+2KI=K2[HgI4](溶解)

(3)2[HgI4]2-=2[HgI3]-+2I-

(4)2I-+ HgCl2(過量)=HgI2↓(紅色)+2Cl-

顯色基團為[HgI4]2-，它的生成與I-濃度密切相關，開始時，Hg2+與I-按反應(1)式生成紅色沉淀HgI2，迅速與過量I-按反應(2)式生成[HgI4]2-，淡黃色顯色基團；當紅色沉淀不再溶解時，表明I-不再過量，應立即停止加入HgCl2，此時可獲得最大量的顯色基團。若繼續(xù)加入HgCl2，反應(3)式和(4)式就會顯著進行，促使顯色基團不斷分解，同時產(chǎn)生大量HgI2紅色沉淀，從而引起納氏試劑靈敏度的降低。

HgCl2-KI-KOH溶液納氏試劑配制的首選方法，該方法關鍵在于把HgCl2的加入量，這決定著獲得顯色基團含量的多少，進而影響方法的靈敏度。方法未給出HgCl2的確切用量，需要根據(jù)配制過程中的現(xiàn)象加以判斷，經(jīng)驗性強，較難把握。我們依據(jù)上述反應原理，根據(jù) (1)式和(2)式得出HgCl2與KI的最佳用量比為0.41∶1。

配置好的試劑應貯存于聚乙烯瓶內(nèi)，冰箱冷藏保存。

2.1.2 酒石酸鉀鈉溶液的配置與貯存

酒石酸鉀鈉溶液配制方法較為簡單，但某些分析純的酒石酸鉀鈉銨鹽含量略高，只靠加熱煮沸并不能完全除去，可采取向酒石酸鉀鈉溶液中加少量堿，煮沸蒸發(fā)后，冷卻并定容，也可向定容后的酒石酸鉀鈉溶液中加入少量納氏試劑，沉淀后取上層清液使用[5]。室溫放置時，酒石酸鉀鈉溶液最多放置30 d，否則會是空白值偏高且不穩(wěn)定，在冰箱中冷藏，放置時間可達半年，且空白值無明顯增大[6]。

2.2 反應條件的確定

2.2.1 顯色時間

國標法中僅提到“放置10 min后測定”，在實際的大批量檢測分析工作中，因無終止反應的操作，很難控制在剛好反應10 min進行比色，因而確定顯色時間對測定結(jié)果的影響十分有必要。經(jīng)實驗測定，在室溫(20～30℃)下顯色不足10 min，吸光度會隨顯色時間的增加而增大，而10～25 min后的吸光度無明顯變化，因此顯色時間控制在10～25 min之間即可。

2.2.2 溫度

溫度會影響納氏試劑與氨氮和氨基氮的反應速度，進而影響測定結(jié)果，選擇顯色時間10 min，溫度在低于15℃時顯色不完全，吸光度明顯低于20到30℃之間反應的吸光度，而高于30℃，吸光度會略微降低。因而無需對反應溫度進行嚴格的控制，在氣溫較高或較低時在空調(diào)間進行實驗即可。

2.2.3 反應體系pH

R-NH2+2[HgI4]2-+3OH-=[Hg2O·R-NH]I+2H20+7I-

由反應公式可知，OH-濃度影響反應平衡，因而反應需在較強堿性環(huán)境下才能進行完全，而微生物發(fā)酵液如未經(jīng)酸化處理，稀釋到檢測倍數(shù)后基本為中性，納氏試劑中OH-含量較高(15%或16%)，樣品稀釋液加入酒石酸鉀鈉和納氏試劑后反應體pH值均大于11.8[6-7]，為堿性環(huán)境，反應體系中OH-含量遠大于氨氮及氨基氮含量，故檢測微生物發(fā)酵液中的氨氮和氨基氮除酸化處理后的樣品外無需調(diào)pH。

2.3 干擾因素的影響及消除

2.3.1 色度與濁度

因比色法是一種基于顯色反應所產(chǎn)生的顏色對透光度具有吸收的性質(zhì)的方法，若待測樣自身帶有顏色或渾濁則會對結(jié)果產(chǎn)生影響，如何消除色度與濁度干擾，是準確測定的關鍵。經(jīng)實驗驗證：對渾濁且色度深的微生態(tài)發(fā)酵液進行檢測時，納氏試劑法可以通過補償校正[8]消除色度與濁度的干擾：空白除不加顯色物質(zhì)碘汞酸鉀外，其它與分析水樣完全相同。

2.3.2 金屬離子

鈣、鎂、鐵離子可與試劑中的強堿產(chǎn)生沉淀，對顯色反應產(chǎn)生影響，顯色前加酒石酸鉀鈉可絡合鈣、鎂，避免干擾。

2.3.3 Cl-

當反應體系中氯離子含量達到接近氨氮和氨基氮含量兩倍時[9]才開始對測量結(jié)果產(chǎn)生影響，而微生物發(fā)酵液中氯的含量要遠低于氨氮和氨基氮的量，故無需加硫代硫酸鈉來消除氯離子的干擾。

3 結(jié)語

理論分析和實驗證實納氏試劑比色法批量檢測耗時少、準確度較高、對反應條件(溫度、pH、反應時間)要求不高、試劑用量少危害小，是最適合微生物發(fā)酵樣品的批量檢測的方法。通過補充說明和改進，納氏試劑比色法試劑的配置和貯藏、反應條件(溫度、時間和pH)的控制和干擾因素對測定結(jié)果的影響，方法的細節(jié)得到了優(yōu)化，準確度得到了提高。

此外，納氏試劑比色法除了能應用于微生物發(fā)酵樣品中氨氮和氨基氮含量的檢測，還可應用于污水中氨氮的測定、氨水含量的測定，另外通過微波消解等手段還可用于食品中蛋白質(zhì)含量的測定。