張 燁,肖 軼,余國龍

(中南大學湘雅醫(yī)院心血管內科,中國湖南長沙410008)

血管新生(angiogenesis)是生長發(fā)育、傷口愈合、腫瘤生長與轉移的重要機制,也是腦梗死、心肌梗死、周圍血管疾病等缺血性疾病的重要治療方法。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)廣泛存在于骨髓、脂肪、臍帶血、外周血、尿液等多種組織和體液中,具有多向分化及自我更新潛能,同時可分泌多種營養(yǎng)因子。在心肌梗死促血管新生治療方面,MSCs等干細胞移植被認為是一項非常有前景的治療措施。但目前MSCs等干細胞移植治療心肌梗死面臨諸多難以克服的問題,例如：移植的干細胞在宿主體內存活率很低；在靶區(qū)域僅發(fā)現極少部分移植的干細胞；MSCs等干細胞移植存在潛在的免疫排斥風險；經冠脈或靜脈大劑量移植干細胞有血栓栓塞風險。盡管如此,實驗與臨床研究顯示MSCs等干細胞移植對心肌梗死仍有明顯的治療效應[1]。近期研究發(fā)現MSCs可能主要通過分泌外泌體,促進心肌梗死后血管新生,從而改善心肌梗死后心肌缺血缺氧微環(huán)境[2]。外泌體(exosome)是由細胞分泌的具有雙層膜結構的直徑40～150 nm的小囊泡,通過向相鄰細胞或者遠端靶組織傳遞微RNA(microRNA,miRNA)、蛋白質等生物活性物質,介導細胞間信號傳遞,從而發(fā)揮心臟保護作用[3～4]。多項實驗研究發(fā)現外泌體通過促血管新生、抗炎作用、抑制細胞凋亡、減少細胞自噬等多種機制,改善心肌梗死后心功能[2,5～6]。外泌體的低毒性、高度穩(wěn)定性、低免疫原性、高效轉運性、與MSCs治療的等效性,以及納米級大小、雙層膜結構、易制取儲存等特性,使其成為極有潛力的心肌梗死后促血管新生的新治療手段或藥物轉運載體。本文主要對MSCs來源外泌體促進心肌梗死區(qū)域血管新生,以及其相關機制和國內外研究現狀作一綜述。

1 血管新生

血管新生是機體內一個復雜的過程,需要內皮細胞與周圍細胞、微環(huán)境的相互作用。病理狀態(tài)下,血管新生功能紊亂,可造成血管滲漏或新生血管成熟障礙。血管新生的機制包括血管生成(angiogenesis)、動脈生成(arteriogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)。狹義的血管新生過程指血管生成。血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后微靜脈發(fā)展而形成新的血管,主要包括：激活期血管基底膜降解；血管內皮細胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網,是一個涉及多種細胞、多種分子的復雜過程[7]。血管生成細胞因子,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等,可直接與受體結合或間接啟動受體激活,進而激活下游信號通路以形成新的毛細血管[8]。動脈生成是由已存在的小動脈互相吻合重建為功能性動脈,建立側支循環(huán),繞過血運中斷部位以改善遠端缺血組織血供。這一過程由狹窄血管處變化的流體剪切力觸發(fā)[9]。血管發(fā)生是指由內皮祖細胞(endothelial progenitor cells)分化、結合形成新的血管叢。在胚胎發(fā)育時期,內皮祖細胞遷移、分化并結合成簇,形成血島(blood islands),血島的外層細胞稱為成血管細胞(angioblasts),可進一步分化成內皮細胞,形成原始血管叢[10]。缺血環(huán)境可以觸發(fā)出生后的血管發(fā)生,動員內皮祖細胞,隨后內皮祖細胞滲入損傷部位,分化為成熟的內皮細胞或通過旁分泌信號調控預先存在的內皮細胞,最終在損傷部位形成新生毛細血管網[11]。

2 外泌體傳遞生物活性物質促心肌梗死區(qū)域血管新生機制

近期研究顯示,MSCs來源的外泌體主要通過傳遞促血管新生相關miRNA、蛋白質等生物活性物質,調控下游血管新生相關通路的基因表達,增強內皮細胞的增殖、遷移和成管能力(詳見表1)[12～18],促進心肌梗死區(qū)域血管新生,增加心肌缺血處營養(yǎng)物質和氧氣的供應,從而改善心肌缺血區(qū)域血流灌注[12～14,16～17]。

2.1 促血管新生相關miRNA

miRNA是一類小的非編碼RNA,其通過與蛋白質編碼相關的mRNA的3′端非編碼區(qū)中的互補序列相互作用,抑制蛋白質翻譯或mRNA降解[19]。外泌體通過傳遞與血管新生相關miRNA,促進下游通路中血管新生相關的基因表達,或間接增強促血管新生相關蛋白質的表達,從而促進心肌梗死區(qū)域血管新生[12～14]。

2.1.1 miRNA-21

miRNA-21是研究證據較多的具有心臟保護作用的miRNA,可以通過促血管新生、抗氧化應激、抗細胞凋亡來保護心臟[20]。Wang等[12]研究發(fā)現MSCs來源的外泌體通過傳遞miRNA-21,調控多種與細胞凋亡/存活相關的靶基因的表達,包括抑制Peli1(pellino 1)、程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor 4,PDCD4)、FasL(Fas ligand)、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)等基因的表達,發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用。在大鼠心肌梗死模型中,人子宮內膜MSCs來源的外泌體通過傳遞miRNA-21,在降低PTEN表達的同時增強Akt表達,從而影響靶細胞內PTEN/Akt信號通路,促進心肌梗死區(qū)域血管新生和心肌細胞存活。同時,該研究發(fā)現人子宮內膜MSCs的促血管新生作用優(yōu)于骨髓MSCs(bone marrow MSCs,BMMSCs)、脂肪MSCs(adipose-derived MSCs,AdMSCs)。Qiao等[21]將來源于心力衰竭患者心肌細胞的外泌體(exosomes derived from the cardiac cells of patients with heart failure,FEXO)與正常心臟心肌細胞來源的外泌體進行比較,發(fā)現心力衰竭病理狀態(tài)改變了FEXO轉運的miRNA,同時FEXO內miRNA-21-5p的含量明顯減少,而且FEXO促進內皮細胞成管的能力明顯下降。有意思的是,FEXO的再生功能障礙可以通過過表達miRNA-21-5p來挽救,這對基因修飾工程外泌體的臨床運用具有指導意義。

2.1.2 miRNA-210

miRNA-210現已被證實是與血管新生相關的miRNA[13,22～24],可以促進心肌梗死區(qū)域血管新生,改善缺血心肌氧供[13,22]。持續(xù)表達miRNA-210的C57小鼠通過上調VEGF表達促進心肌梗死區(qū)域血管新生,且miRNA-210基因修飾小鼠在1年內未觀察到致癌副作用[22]。缺氧環(huán)境中的MSCs來源的外泌體通過miRNA測序發(fā)現,其miRNA-210含量較正常氧環(huán)境中的外泌體明顯增多,同時缺氧環(huán)境下機體可能通過缺氧誘導因子α(hypoxia inducible factor-1,HIF-α)活化中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2,nSMase2),以提高外泌體分泌,從而顯著提高MSCs來源的外泌體的促血管新生能力[13]。此外,miRNA-210在外周動脈疾病、缺血性腦卒中等缺血性疾病中也具有促進血管新生的作用[23～24]。

2.1.3 miRNA-132

研究表明miRNA-132通過抑制p120RasGTP蛋白酶(p120 Ras GTPase)活化,促進cAMP應答元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)磷酸化,進而引起Ras蛋白(Ras protein)激活及促血管新生[25～26]。Ma 等[14]研究發(fā)現通過電穿孔技術將miRNA-132與外泌體結合后,miRNA-132可通過下調Ras p21蛋白活化子1(Ras p21 protein activator 1,RASA1)的表達,促進人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)及心肌梗死區(qū)域血管形成。

2.2 促血管新生相關蛋白質

MSCs來源的外泌體除了可以向靶細胞傳遞miRNA,還可以傳遞具有促血管新生功能的蛋白質。這些外泌體通過直接傳遞或者間接調控血管新生相關蛋白質的表達[15～18],促進心肌梗死區(qū)域血管新生,從而改善缺血缺氧環(huán)境[16～17]。

2.2.1 促血管生成因子

缺氧狀態(tài)下人脂肪MSCs來源的外泌體可傳遞多種促血管生成因子(pro-angiogenic factors),如VEGF、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管內皮生長因子受體2/3(vascular endothelial growth factor receptor 2/3,VEGFR2/3)、單核細胞趨化蛋白2/4(monocyte chemotactic protein 2/4,MCP-2/4),促進體內和體外的血管新生,其作用主要通過調節(jié)VEGF/VEGF-R信號通路完成。VEGF/VEGF-R信號通路可誘導血管新生相關基因表達,調節(jié)血管通透性,促進內皮細胞遷移、增殖和存活,在調節(jié)血管新生中發(fā)揮關鍵作用[15]。

2.2.2 基質衍生因子1

基質衍生因子1(stromal-derived factor 1,SDF1)是組織修復和血管新生的關鍵趨化因子[27],在心肌梗死后起心臟修復作用[28]。在缺血缺氧環(huán)境下,SDF1/CXCR4通路相關蛋白質表達增加,使基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表達上調,進而引起胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK 1/2)和PI3K/Akt通路相關蛋白質的表達增加,最終促進缺血性腦卒中神經元細胞恢復、內皮細胞血管新生[29]。人臍帶血MSCs通過分泌外泌體傳遞SDF1,激活PI3K信號通路,促進內皮細胞及心肌梗死周圍區(qū)域微血管生成[16]。

2.2.3 血小板衍生生長因子D

血小板衍生生長因子D(platelet-derived growth factor D,PDGF-D)主要在內皮細胞和平滑肌細胞中表達,可促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成[30]。甲狀腺激素T3通過上調PDGF/PDGFR-β表達,激活Akt通路,促進甲狀腺功能減退小鼠的心臟血管新生[31]。將Akt修飾的外泌體(Akt-Exo)與正常外泌體(Exo)進行比較發(fā)現,Akt-Exo中PDGF-D蛋白的表達顯著增多,而VEGF、CD31和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等蛋白質的表達并無明顯差異,同時Akt-Exo中傳遞的PDGF-D通過與PDGFR-β受體結合促進心肌梗死區(qū)域血管新生,而且Akt-Exo在體外可促進內皮細胞增殖、遷移和血管形成,并增加血管內膜的形成[17]。

2.2.4 惡性腦腫瘤缺失蛋白1

惡性腦腫瘤缺失蛋白1(deleted in malignant brain tumors 1,DMBT1)是一種重要的細胞外基質蛋白質,可與半乳糖凝集素-3(galectin-3)、EGF、VEGF和Dll4(delta-like 4)相互作用并調節(jié)Notch信號通路差異表達,從而促進內皮細胞黏附、遷移、增殖和血管生成[32]。Chen等[18]研究發(fā)現人尿源性MSCs來源的外泌體(USC-Exos)通過傳遞DMBT1,增加內皮細胞中VEGF-A和磷酸化Akt蛋白的表達,從而促進內皮細胞及糖尿病小鼠皮膚傷口處的血管新生。

綜上所述,MSCs來源外泌體通過傳遞具有促內皮細胞增殖、遷移和血管形成功能的miRNA或蛋白質至心肌梗死區(qū)域,促進心肌梗死區(qū)域的血管新生。為了驗證外泌體傳遞的與促血管新生效應相關的可能功能分子,利用基因干擾技術沉默親本細胞MSCs內與血管新生相關的miRNA-21[12]、miRNA-21-3p[33]或蛋白質 PDGF-D[17]、DMBT1[18],結果發(fā)現外泌體介導的促血管新生作用僅部分減弱,并未完全消失,這說明外泌體可能通過傳遞多種促血管新生功能分子共同促進血管新生,并非轉運單一miRNA或蛋白質促血管新生。目前,外泌體促心肌梗死血管新生的具體機制仍需進一步探究。

3 外泌體促血管新生功能在心肌梗死治療中的研究現狀

MSCs通過分泌外泌體的形式向心肌細胞或內皮細胞傳遞生物活性物質,促進心肌梗死區(qū)域的血管新生,改善心肌梗死后的缺血缺氧微環(huán)境[2]。通過基因修飾手段增強外泌體介導的心臟修復作用[34～35],或將外泌體與生物活性肽結合形成工程外泌體以靶向缺血心肌治療[36～40],是目前外泌體在心血管領域的熱點研究方向。

3.1 通過基因修飾增強外泌體促血管新生及心臟修復作用

外泌體可通過促進心肌梗死區(qū)域血管新生、抑制炎癥反應、抗細胞凋亡、減少細胞自噬等多種機制減輕心肌梗死后的心肌纖維化,改善心臟功能。缺血缺氧等病理條件可以改變外泌體傳遞的內容物并損害其再生能力[21]。通過基因修飾手段過表達外泌體中具有心臟保護作用的生物活性物質,如前文所述的miRNA或蛋白質,可增強外泌體介導的心臟保護作用,逆轉病理環(huán)境對外泌體再生能力的影響。Ni等[34]發(fā)現組織型基質金屬蛋白酶抑制劑2(tissue matrix metalloproteinase inhibitor 2,TIMP2)修飾的人臍帶血MSCs來源的外泌體(exosomes derived from TIMP2-overexpressing human umbilical cord MSCs,huc-exoTIMP2)通過激活Akt/Sfrp2通路,可以抑制心肌細胞凋亡,促進血管生成,改善細胞外基質重塑,從而改善心肌缺血。與正常huc-exo相比,huc-exoTIMP2增加了心肌梗死大鼠心肌中CD31+和凝集素免疫活性細胞的數量,促進了心肌梗死區(qū)域的血管新生。Wang等[35]發(fā)現熱休克蛋白20(heat shock protein 20,Hsp20)修飾的外泌體可以通過傳遞細胞保護性蛋白質,如磷酸化的Akt、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和存活蛋白,減輕心肌氧化應激反應,減少心肌纖維化,促進心臟血管新生,從而改善糖尿病性心肌病的心室重構,而且過表達的Hsp20還可以與腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,Tsg101)蛋白直接相互作用,以促進心肌細胞中的外泌體生成。Ma等[17]研究發(fā)現與正常外泌體(Exo)相比,Akt修飾的外泌體(Akt-Exo)在體外可增強內皮細胞的增殖、遷移、成管能力,在體內也可明顯提高心肌梗死動物模型的左心室射血分數,改善心臟功能。

表1 MSCs來源外泌體促血管新生及機制Table 1 Exosomes derived from mesenchymal stem cells promote angiogenesis and its mechanisms

3.2 靶向心臟的工程外泌體促進血管新生

目前已有多項研究證明外泌體可以有效促進心肌梗死后血管新生。既往動物實驗多采用直接心內注射或尾靜脈注射等方法傳遞外泌體。直接心內注射需要嚴格的無菌環(huán)境及繁瑣的操作過程,臨床應用困難。而且,相關研究報道心內注射外泌體3 h后在心肌梗死區(qū)域很難檢測到熒光標記的外泌體信號[36]。現有研究表明,經尾靜脈注射傳遞的外泌體大部分經肝臟攝取代謝[41],而通過靜脈注射大劑量外泌體來提高心臟攝取量的方法具有潛在的致血栓栓塞風險。因此,如何有效傳遞外泌體及提高心臟靶器官對外泌體的攝取是目前外泌體實際臨床運用前急需解決的問題。

通過修飾親本細胞或分離后修飾組裝成工程外泌體,可有效靶向運輸外泌體至缺血心臟組織。PGN水凝膠(PGN hydrogel)可通過增強外泌體在心臟的保留和表達來促進心臟修復。與單純的外泌體相比,Exo-PGN水凝膠治療組在心梗后21 d仍能在缺血心臟組織中檢測到PKH-26標記的外泌體信號,顯著提高了外泌體在心臟中的持續(xù)穩(wěn)定表達[36]。缺血心肌靶向肽(ischemic myocardiumtargeted peptide,IMTP)的肽段序列(CSTSMLKAC)可特異性與缺血心肌細胞結合[42],將IMTP與外泌體結合,可靶向運輸外泌體至缺血心臟[37～39],增強缺血心臟對外泌體的攝取,從而促進心肌梗死區(qū)域血管新生[37～38]。血小板納米囊泡或抗肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)抗體可靶向缺血損傷心肌[43～44],將其與外泌體結合形成工程外泌體,有助于外泌體靶向缺血心臟治療。RGD生物活性肽(Arg-Gly-Asp peptide)可以與位于血管腔表面的重要血管外基質蛋白整合素 αvβ3(integrin αvβ3)特異性結合,Wang等[40]將外泌體與RGD生物活性肽結合形成工程外泌體,靶向運輸外泌體至血管腔表面,不僅可提高HUVECs對外泌體的攝取量,而且可增強VEGF分泌,從而促進HUVECs的增殖、血管形成能力。同時,將其與仿生納米顆粒SPIONs(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)、糖代謝前體Ac4ManNAz(tetraacetylated N-azidoacetyl-D-mannosamine)結合,采用聚糖成像檢測技術,成功追蹤到工程外泌體 (RGD-Ac4ManNAzexosomes)在體內的促血管新生效應,即與未注射組相比,RGD-Ac4ManNAz-exosomes組體內的新生血管長度明顯增加。

4 小結與展望

綜上所述,MSCs來源的外泌體通過傳遞miRNA、蛋白質等生物活性物質,調控血管新生相關通路蛋白質的表達,增強內皮細胞的增殖、遷移和成管能力,促進心肌梗死區(qū)域血管新生,改善心肌梗死后缺血缺氧微環(huán)境,促進心肌梗死后心臟功能的恢復?；蛐揎椏捎行г鰪娡饷隗w的促血管新生及心臟保護作用,靶向缺血心肌的工程外泌體也可有效提高外泌體在心肌梗死區(qū)域的攝取及停留,從而增強外泌體的促血管新生作用。

MSCs來源外泌體作為無細胞性促血管新生治療手段,既保留了親本MSCs細胞的促血管新生特性,又成功避免了前文所述MSCs細胞移植治療的諸多困難。利用基因手段過表達外泌體傳遞的功能物質或靶向缺血心臟治療,可以明顯增強外泌體的促血管新生及心臟保護作用。為了更好地利用外泌體的促血管新生功能,應進一步研究外泌體傳遞的內容物及其介導的分子生物學機制。同時,外泌體作為促血管新生藥物進入臨床試驗之前,仍有許多方面需要進一步完善和探究,例如：發(fā)掘新型材料進一步提高外泌體對缺血心臟的靶向性和促血管新生效應,延長外泌體在缺血心臟的停留時間；開發(fā)更高效、簡便的外泌體提取方法；運用聚糖成像[40]、磁共振成像[45]等高科技檢測技術在心肌梗死動物模型體內進一步評估外泌體的促血管新生效應；評估MSCs來源外泌體長期促血管新生治療的有效性及是否存在潛在的致癌風險等。盡管面臨許多挑戰(zhàn),但是外泌體仍然是極具潛力的促心肌梗死血管新生的治療手段。