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      不同基原紫蘇子及炮制品的化學(xué)成分差異性研究

      2020-06-03 06:39:16馬瑞瑞羅宇琴楊小龍官永河李國衛(wèi)孫冬梅陳向東
      關(guān)鍵詞:紫蘇子基原蘇子

      馬瑞瑞,羅宇琴,楊小龍,官永河,李國衛(wèi),孫冬梅,陳向東

      (廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

      唇形科紫蘇屬一年生草本植物紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.有1個種、3個變種和7個變型,3個變種分別為白蘇Perillafrutescens(L.) Britt var typica (Makino) Makino、紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var acuta (Thunb.) Kudo和皺紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var crispa(Thunb.) Decne。本植物變異極大,我國古書上稱葉全綠的為白蘇,稱葉兩面紫色或面青背紫的為紫蘇,白蘇的花通常白色,紫蘇花常為粉紅至紫紅色,白蘇被毛通常稍密,果萼稍大,香氣亦稍遜于紫蘇[1]。2015年版《中國藥典》僅收載紫蘇子作為藥用植物來源[2],因藥材細(xì)小,歷來混偽品較多。孫俊英[3]等對山東省市售的51批紫蘇子進(jìn)行質(zhì)量分析,結(jié)果顯示市售紫蘇子飲片不合格率較高,摻偽摻雜現(xiàn)象較嚴(yán)重。

      目前,研究紫蘇子及其變種白蘇子鑒別的文獻(xiàn)較少,樊寶和等[4]通過紫外光譜及薄層色譜法研究紫蘇子和白蘇子成分的差異,發(fā)現(xiàn)紫蘇子與白蘇子成分雖有相同之處,但也有差異,不宜等同入藥。王雪利等[5]對目前市場上流通的紫蘇子及其偽品的微性狀進(jìn)行真?zhèn)螌Ρ辱b別,得到在網(wǎng)眼大小、表面是否存在向上凸起的網(wǎng)脊以及是否存在腺鱗等性狀方面紫蘇子及其混偽品存在較大差異。黃亮輝等[6]采用HPLC法測定白蘇子和紫蘇子生品及其不同炮制品中迷迭香酸的含量,通過蘇子的HPLC圖中特征峰的強(qiáng)弱,可以區(qū)分白蘇子與紫蘇子。李燕等[7]對基于HPLC指紋圖譜的紫蘇子及其炮制品的質(zhì)量進(jìn)行研究,通過蘇子的HPLC圖中特征峰(峰)的缺失區(qū)分紫蘇子與其炮制品炒紫蘇子。以上研究均未考察紫蘇子及白蘇子化學(xué)成分的差異性,本文通過建立紫蘇子的UPLC特征圖譜,對紫蘇子、白蘇子及炒紫蘇子進(jìn)行對比分析,為紫蘇子藥材的鑒別提供依據(jù)。

      1 材料與儀器

      1.1 儀器

      Waters H-Class型超高效液相色譜儀(沃特世公司),Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);KQ-500型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

      1.2 材料

      紫蘇子及白蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供,經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定分別為紫蘇子Perillafrutescens(L.) Britt.及白蘇子Perillafrutescens的干燥成熟果實(shí),其中炒紫蘇子為實(shí)驗(yàn)室自制,樣品信息見表1。

      表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

      1.3 試藥

      咖啡酸對照品(批號:110885-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)、迷迭香酸對照品(批號:110871-201706,質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.5%)、木犀草素對照品(批號:111520-201605,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)、芹菜素對照品(批號:111901-201603,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑為分析純。

      2 方法

      2.1 色譜條件

      以Agilent SB C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)為色譜柱;以乙腈為流動相A,0.1%甲酸溶液為流動相B,梯度洗脫(0~6 min,10%→18%A;6~15 min,18%→50%A);流速為0.3 mL/min;檢測波長為330 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

      2.2 對照品溶液的制備

      精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素對照品適量,加80%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液制成含每1 mL含咖啡酸32.6617 μg、迷迭香酸256.658 μg、木犀草素36.364 μg、芹菜素37.751 μg的混合對照品儲備液。取混合對照品儲備液1 mL,加80%甲醇定容于10 mL,得到每1 mL含咖啡酸3.266 μg、迷迭香酸25.666 μg、木犀草素3.636 μg、芹菜素3.775 μg的混合對照品溶液。置于4 ℃冰箱中保存,備用。

      2.3 供試品溶液的制備

      取紫蘇子飲片(過2號篩)適量,取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流60 min,放冷,用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

      2.4 方法學(xué)考察

      2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取紫蘇子藥材按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液,各進(jìn)樣2 μL,色譜圖見圖1??梢?該分析方法能正確檢測所指認(rèn)的特征峰,陰性無干擾。

      ABC0.40.20.00.40.20.00.40.20.0AU051015t/min

      A.空白溶液; B.混合對照品溶液; C.紫蘇子供試品溶液;峰2.咖啡酸;峰7.迷迭香酸;峰11.木犀草素;峰12.芹菜素。

      圖1紫蘇子特征圖譜專屬性考察

      Figure1The specificity of characteristic chromatograms ofPerillasubplants

      2.4.2 精密度試驗(yàn) 取紫蘇子藥材,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以迷迭香酸峰為參照峰S,計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積,結(jié)果各色譜峰相對保留時間RSD值均<1%,相對峰面積的RSD值均<5%,表明儀器精密度良好。

      2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取紫蘇子藥材,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣。以迷迭香酸峰為參照峰S,計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積,結(jié)果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%,相對峰面積的RSD值均<5%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

      2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紫蘇子藥材,按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。以迷迭香酸峰為參照峰S,計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積,結(jié)果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%,相對峰面積的RSD值均<5%,表明方法重復(fù)性較好。

      2.4.5 中間精密度試驗(yàn) 不同人員在不同時間,取同一批紫蘇子按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件在不同儀器分別進(jìn)樣。以迷迭香酸峰為參照峰S,計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積,結(jié)果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%,相對峰面積RSD值均<5%,表明方法中間精密度較好。

      2.5 樣品測定

      基于已建立的特征圖譜方法對紫蘇子不同炒制品進(jìn)行測定,以迷迭香酸峰為參照峰,分別計(jì)算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積。

      3 結(jié)果與分析

      3.1 樣品測定結(jié)果

      對上述23批樣品的特征圖譜進(jìn)行測定,以迷迭香酸峰為參照峰,分別計(jì)算各色譜峰相對峰面積,結(jié)果見表2??梢姡翰煌咸K子及其炮制品相對峰面積的RSD值在35.15%~162.59%范圍,表明不同基原紫蘇子及其炮制品之間有明顯差異。從不同產(chǎn)地紫蘇子來看,河北省安國市的3批紫蘇子(Z8、Z9、Z10)與炒紫蘇子(C8、C9、C10)表現(xiàn)為峰4缺失,說明不同產(chǎn)地間的樣品也存在成分差異。

      3.2 單因素方差分析

      對不同基原紫蘇子及其炮制品的特征圖譜相對峰面積通過SPSS V 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析,結(jié)果見表3。方差齊性檢驗(yàn)中,峰2、峰3不滿足方差齊性的假設(shè)(P<0.05),考慮到這兩個峰數(shù)據(jù)較小,所以剔除;單因素方差分析中,峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰10、峰11及峰12在不同基原紫蘇子及其炮制品存在顯著差異(P<0.05),推斷基于上述特征峰可實(shí)現(xiàn)對不同基原紫蘇子及炮制品進(jìn)行有效區(qū)分。

      3.3 多重比較

      基于單因素方差分析結(jié)果,采用最小顯著差數(shù)法LSD進(jìn)一步對不同基原紫蘇子及其炮制品進(jìn)行多重比較[8],結(jié)果見表4。

      表2 23批樣品特征圖譜相對峰面積測定結(jié)果Table 2 The relative peak area of 23 lots of sample characteristic chromatograms

      表3 方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析Table 3 Homogeneity of variance test & One-way anova

      表4 多重比較結(jié)果Table 4 Results of multiple comparisons

      由表4可見,不同基原紫蘇子及其炮制品間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),將多重比較相關(guān)信息整理,可以得出3組不同樣品之間存在顯著差異的特征峰,結(jié)果見表5。

      表5 組間差異特征峰Table 5 The characteristic peaks of difference between groups

      由表5和圖2可見,紫蘇子與炒紫蘇子的峰1、峰2、峰3及峰12,紫蘇子與白蘇子的峰3、峰5、峰6、峰11及峰12,炒紫蘇子與白蘇子的峰1、峰2、峰5、峰6及峰10之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3.4 主成分分析

      用SPSS V20.0軟件對23批樣品特征圖譜所得的11個共有峰進(jìn)行主成分分析,得出相關(guān)矩陣的特征值及方差分析,結(jié)果見表6。可見,前3個成分的特征值分別為4.253、2.472、2.272,對于總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)81.792%,基本保留了原樣本信息,所以確定提取的主成分?jǐn)?shù)為3個。根據(jù)主成分載荷矩陣表7可知,峰8和峰13對主成分1的影響最大,峰2對主成分2的影響較大,峰3對主成分3的影響最大。以3個主成分分別作為X、Y、Z軸得23個樣品的主成分得分圖,可以將23批樣品分為3類,即Ⅰ類紫蘇子、Ⅱ類炒紫蘇子、Ⅲ類白蘇子,見圖3。主成分3在炮制后降低,可能是由于峰3對于溫度比較敏感,可以用峰3來區(qū)分紫蘇子與炒紫蘇子,與多重比較結(jié)果一致。在Ⅰ類中有3批炒紫蘇子(C4、C5、C6),在Ⅱ類中有1批紫蘇子(Z8),這4組樣品(C8和Z8,C4和Z4,C5和Z5,C6和Z6)分布位置靠近,推測可能是由于該4組樣品與其他樣品的組間差異較樣品炮制前后的組內(nèi)差異大導(dǎo)致。

      ZSZCZSZZSZCZSZCZSZBSZZSZBSZCZSZBSZCZSZBSZF1F2F10F3F6F12F11F1F2F12F30.030.020.010.000.150.100.050.000.150.100.050.00ABCD(F5)E(F6)F

      A:紫蘇子與炒紫蘇子相對峰面積均值對比圖; B~C:紫蘇子與白蘇子相對峰面積均值對比圖; D~F:炒紫蘇子與白蘇子相對峰面積均值對比圖。

      圖2不同基原紫蘇子及其炮制品相對峰面積均值對比圖

      Figure2Comparison of the mean relative peak area ofPerillaseedsand their processed products

      表6 特征值及方差分析Table 6 Characteristic value and analysis of variance

      表7 主成分載荷矩陣Table 7 Principal component load matrix

      主成分1主成分2主成分3

      圖3主成分得分圖
      Figure3Principal component score plot

      4 結(jié)論

      本研究在建立紫蘇子UPLC特征圖譜方法的基礎(chǔ)上,通過單因素方差分析、多重比較及主成分分析,對紫蘇子、炒紫蘇子及白蘇子的化學(xué)成分進(jìn)行了比較,總結(jié)出紫蘇子炮制前后及不同基原間的成分差異規(guī)律,為紫蘇子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、品質(zhì)評價提供了參考;建立的紫蘇子的UPLC特征圖譜方法重現(xiàn)性良好,樣品制備簡單,分析時間短,為紫蘇子的質(zhì)量控制提供參考。

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