利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建擬南芥IQM家族基因四突變體

魏麗茵 呂天曉 范甜 周玉萍 田長恩

摘 要之前，本研究組分別對IQM家族基因的功能進(jìn)行了研究。不過，由于缺乏相應(yīng)突變體而未能對該家族多基因同時(shí)突變所產(chǎn)生的生長發(fā)育改變進(jìn)行研究。因此，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建IQM家族多基因突變體。分別在IQM家族4個(gè)成員的基因組上設(shè)計(jì)靶點(diǎn)接頭，通過同源重組構(gòu)建成相應(yīng)小載體sgRNA表達(dá)盒：LazAtU3d-AtU3b-AtU3d-AtU3b，并整合成pYLCRISPR/Cas9Pubi-N表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入擬南芥。經(jīng)抗生素抗性篩選，共獲得70株T0代植株。最后經(jīng)過編輯靶點(diǎn)測序，得到2個(gè)IQM1～I(xiàn)QM4的四突變體株系。

關(guān)鍵詞擬南芥;IQM;四突變體;CRISPR/Cas9

IQM家族由6個(gè)成員組成，命名為IQM1～I(xiàn)QM6。生物信息學(xué)分析表明，IQM蛋白均含有1個(gè)IQ基序，其N-端和C-端分別與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A和天花粉素具有較高的同源性，是1個(gè)全新的含IQ基序的家族（Zhou et al， 2010;田長恩等， 2013）。

本研究組長期從事IQM家族的功能研究，發(fā)現(xiàn)IQM1介導(dǎo) CaM、光和部分非生物脅迫信號，調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)和根生長（Zhou et al， 2012）。還發(fā)現(xiàn)，IQM1可通過與CAT2互作而增強(qiáng)其活性，繼而提高JA合成酶ACX2和ACX3的活性，增加JA含量和對灰質(zhì)芽孢桿菌的抗性（Lv et al，2019）。IQM2可能通過影響光合作用而參與植物對病菌的反應(yīng)（吳俊等，2017）。IQM3在葉、莖、花和根中的表達(dá)較強(qiáng)，但在莢果中很弱，與種子萌發(fā)及幼苗子葉膨大有關(guān)（周玉萍等，2009）;IQM3還可能通過抑制赤霉素的生物合成而參與對幼苗的側(cè)根數(shù)量和主根長度的調(diào)節(jié)（徐浩等，2019）。IQM4在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用（蕭文慧等，2016）;還與種子休眠和萌發(fā)成正相關(guān)（Zhou et al， 2018）。

總之，IQM家族不同成員具有不同功能。因此，有必要構(gòu)建擬南芥IQM家族的多突突變體，為深入研究擬南芥IQM家族基因的功能提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以野生型擬南芥Columbia-0（Col-0）為基礎(chǔ)進(jìn)行基因編輯，同時(shí)敲除IQM基因家族中的4個(gè)成員IQM1～I(xiàn)QM4。質(zhì)粒pCambia1301和大腸桿菌（菌株 E.Coli DH5α）由本實(shí)驗(yàn)室保藏;根瘤農(nóng)桿菌（菌株 GV3101）由中國科學(xué)院華南植物園張明永教授友好轉(zhuǎn)贈(zèng)的;CRISPR/Cas9基因編輯體系小載體 pYLsgRNA-AtU3d/LacZ、pYLsgRNA-AtU3b和大載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-N均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授友好贈(zèng)送。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

參照Ma和Liu （2016）的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行。首先，在IQM1至IQM4的基因組序列中設(shè)計(jì)4對靶點(diǎn)接頭（表1），分別退火連成小片段， 同源重組入經(jīng)BsaI線性化的載體pYLsgRNA-AtU3d/LacZ和pYLsgRNA-AtU3b中，然后，進(jìn)行g(shù)RNA表達(dá)盒擴(kuò)增，回收預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物， 連接進(jìn)雙元載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌;繼而，進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌落PCR鑒定， 選擇陽性克隆測序驗(yàn)證;進(jìn)一步，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌， 并用菌落PCR鑒定得到轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌;再進(jìn)一步，通過農(nóng)桿菌蘸染花蕾法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥， 收獲種子并在含有卡拉霉素（Kan）的培養(yǎng)基上篩選出抗性植株即候選T0代編輯植株;最后，用靶點(diǎn)上、下游引物（表1）對候選株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 將產(chǎn)物測序， 選出雙鏈都成功編輯的轉(zhuǎn)基因植株留種，供純合子篩選。

2 結(jié)果與分析

本文利用CRISPR/Cas9對野生型擬南芥的4個(gè)基因（IQM1、IQM2、IQM3和IQM4）進(jìn)行編輯。對編輯的T0代進(jìn)行抗生素抗性篩選，共獲得70株抗性苗;繼而，對這些苗及其后代進(jìn)行跨靶點(diǎn)PCR產(chǎn)品測序，在T4代中篩選到2個(gè)四突變體純合株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1和（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2，其相應(yīng)的DNA序列和突變蛋白的氨基酸序列（見圖1）。

與野生型（WT）相比，四突變體（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1的突變位點(diǎn)分別是：iqm1，從起始密碼子ATG的A開始，在第41與42堿基之間插入1個(gè)A，導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變并提前終止，產(chǎn)生1個(gè)只有29個(gè)氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM1共有526個(gè)氨基酸殘基（圖1-A）;iqm2：從起始密碼子ATG的A開始的第49至64堿基之間缺失16個(gè)堿基，導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變并提前終止，產(chǎn)生1個(gè)只有21個(gè)氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM2共有605個(gè)氨基酸殘基（圖1-B）;iqm3：從起始密碼子ATG的A開始的第40至68堿基之間缺失29個(gè)堿基，導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變并提前終止，產(chǎn)生1個(gè)只有25個(gè)氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM3有456個(gè)氨基酸殘基（圖1-C）;iqm4：從起始密碼子ATG的A開始在第170與171堿基之間上插入1個(gè)T，導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變并提前終止，產(chǎn)生1個(gè)只有81個(gè)氨基酸殘基的突變蛋白， 而野生型有532個(gè)氨基酸殘基（圖1-D）。

與上述突變體比較，另1個(gè)株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2只在IQM2中存在的不同：從起始密碼子ATG的A開始在第64與65堿基之間插入1個(gè)A，導(dǎo)致其后序列發(fā)生移碼突變并提前終止， 產(chǎn)生1個(gè)只有24個(gè)氨基酸殘基的突變蛋白， 而IQM2有605個(gè)氨基酸殘基（圖1-E）。

3 討論

本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)對擬南芥IQM家族4個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，成功獲得2個(gè)四突變體株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1和（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2。之后，將在上述四突變體的基礎(chǔ)上，再編輯該家族其余的IQM5和IQM6基因，以期獲得IQM全家族基因的六突變體。為研究IQM家族基因同時(shí)突變對植物生長發(fā)育以及對環(huán)境反應(yīng)的影響提供材料。

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