蜚蠊目RNA干擾的應(yīng)用研究進(jìn)展及展望

馬云峰 李紹斌 楊松 黎玄鋼

摘 要蜚蠊目昆蟲的一些成員是世界公認(rèn)的害蟲，嚴(yán)重影響人類生活健康，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)可以減少蜚蠊目昆蟲的數(shù)量以及疾病的傳播。RNA干擾是外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA經(jīng)過Dicer酶加工處理為小干擾RNA（siRNA）與標(biāo)靶基因結(jié)合，使相應(yīng)標(biāo)靶基因沉默的現(xiàn)象，從而阻止某一基因功能在細(xì)胞或整體水平上的表達(dá)，具有高效性和特異性等優(yōu)勢(shì)。RNAi技術(shù)作為研究基因功能的研究工具被廣泛運(yùn)用，并顯示出開發(fā)新型有害生物管理策略的巨大潛力。近年來，此技術(shù)已被廣泛成功應(yīng)用于多種昆蟲中，目前為止，只有較少文獻(xiàn)關(guān)于蜚蠊目昆蟲RNAi的報(bào)道。本文綜述了RNAi在蜚蠊目中的應(yīng)用研究進(jìn)展，并展望了今后的研究方向。

關(guān)鍵詞蜚蠊目;基因;RNA干擾;雙鏈RNA;研究進(jìn)展

0 前言

蜚蠊俗稱蟑螂，屬于昆蟲綱（Insecta）、蜚蠊目（Blattaria），其中一些種類在醫(yī)學(xué)與經(jīng)濟(jì)方面有巨大的危害性，它是世界性衛(wèi)生害蟲，包括美洲大蠊（Periplaneta americana）、澳洲大蠊（Periplaneta australasiae）、東方蟑螂（Blatta orientalis）、德國小蠊（Blattaria germanica），能夠機(jī)械性傳播多種致病菌，如痢疾桿菌、沙門桿菌、變形桿菌和寄生蟲卵等病原體，是人類諸多疾病的傳播媒介;其排泄物和蛻落的表皮可能會(huì)帶有過敏原，從而引起過敏性疾病的發(fā)生[1]。

1 RNAi抑制蜚蠊產(chǎn)卵及疾病的傳播

作為世界公認(rèn)的衛(wèi)生性害蟲之一的蜚蠊[1]，嚴(yán)重影響人類生活和健康。蜚蠊類害蟲具有驚人的繁殖速度，導(dǎo)致其種群數(shù)量龐大，而且糞便中攜帶七種過敏原[8]，直接暴露與人類的接觸，增加人類發(fā)病率。因此，利用RNAi是一種有效控制蜚蠊數(shù)量及疾病傳播的方法。有實(shí)驗(yàn)研究表明，蜚蠊糞便中含有過敏原且是蜚蠊體內(nèi)的Blag 1蛋白起作用[8]，通過注射dsRNA抑制蜚蠊體內(nèi)Blag 1 mRNA的表達(dá)，使蜚蠊消化能力下降，排便較少。經(jīng)檢測(cè)，注射dsRNA的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組的Blag 1 蛋白的含量，且在第6天后，未注射的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量將近注射dsRNA的蜚蠊的9倍[8]，注射dsRNA減少了過敏原的排出，從而降低了與人類接觸的幾率，從而降低人類發(fā)病率。注射dsRNA還會(huì)影響蜚蠊體內(nèi)保幼激素的合成量，從而影響蜚蠊的正常發(fā)育，而且還會(huì)影響卵黃細(xì)胞的成熟。注射dsOKs（Double-stranded Orcokinins）會(huì)降低OK（Orcokinin）基因mRNA的表達(dá)，影響卵母細(xì)胞的生長[9]，降低了雌性蜚蠊受精成功率，從而減少蜚蠊的出生率?？偟膩碚f，利用RNAi技術(shù)能夠有效控制蜚蠊種群數(shù)量和疾病的傳播，特別是過敏原的傳播。

2 dsRNA導(dǎo)入蜚蠊體內(nèi)的方法

目前，對(duì)昆蟲的然RNAi技術(shù)的研究已比較成熟，將dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)普遍使用的方法有注射法和喂食法兩種。

注射法：將體外合成的dsRNA通過微量注射器注射到昆蟲體內(nèi)，是目前應(yīng)用最普遍的導(dǎo)入方法。Kennerdell和Carthew用顯微注射的方法將dsRNA注入果蠅胚胎中，實(shí)現(xiàn)了用RNAi技術(shù)對(duì)昆蟲基因功能的研究。繼 RNAi技術(shù)在果蠅的成功應(yīng)用之后，通過人工介導(dǎo)的方式引入dsRNA昆蟲體內(nèi)，產(chǎn)生缺陷型個(gè)體來研究基因的功能已被越來越多的昆蟲學(xué)家應(yīng)用[5]。采用RNAi技術(shù)注射dsRNA，抑制蜚蠊目昆蟲相應(yīng)標(biāo)靶基因的表達(dá)。利用注射的方式向蜚蠊目昆蟲體內(nèi)導(dǎo)入dsRNA，注射位置通常在第三腹節(jié)和第四腹節(jié)之間[8]，據(jù)其他文獻(xiàn)報(bào)道，小蠊的頭部和胸部也可以注射，但只有腹部注射效果最好[9]，原因是注射頭部，頭部神經(jīng)比較多，容易造成死亡，成功率不高，注射胸部，肌肉過多，不易注射。注射需控制注射量，加入注射量過少，干擾效果不明顯，隨著注射量的增加一定量之前，干擾效果會(huì)更加明顯[8]，但超過一定量后，會(huì)致死小蠊。但是RNAi產(chǎn)生顯著干擾效果持續(xù)時(shí)間不長，在一段時(shí)間后抑制效果會(huì)減弱甚至消失一般在6天或12天[10]。由于德國小蠊血液中含有的少量能夠降解dsRNA的物質(zhì)[10]，因此，為了注射的dsRNA作用效果更好，采用脂質(zhì)體將其包裹，注射進(jìn)入血液循環(huán)，更加容易與標(biāo)靶細(xì)胞結(jié)合。由于注射法的適用范圍較為限制，只能在實(shí)驗(yàn)室使用，從而可以采用另一種適用范圍較廣的方法-喂食法。

喂食法：根據(jù)昆蟲都具有取食的行為特點(diǎn)，科學(xué)家使用喂食dsRNA將其導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)。喂食dsRNA操作簡單方便，容易實(shí)現(xiàn)，且對(duì)昆蟲損失小[6]，因此在大多數(shù)情況下，可能是運(yùn)用范圍較廣且比較普遍適用的一種dsRNA導(dǎo)入方法。通過將dsRNA從小蠊口器中進(jìn)入食道，小腸上皮細(xì)胞吸收dsRNA進(jìn)入細(xì)胞。對(duì)昆蟲的相關(guān)研究表明，dsRNA的攝取與網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用和巨胞吞作用有關(guān)[3]。細(xì)胞攝取 dsRNA的機(jī)制為系統(tǒng)性RNA干擾缺陷型2（systemic RNA interference defective 2，Sid2）的腸腔內(nèi)跨膜蛋白的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，在其中它充當(dāng)昆蟲中攝入的 dsRNA的內(nèi)吞受體，進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞通過網(wǎng)格蛋白依賴性和其他內(nèi)吞途徑攝取的 dsRNA通過內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到這些細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)，將喂食的dsRNA轉(zhuǎn)化為 siRNA[3]，讓siRNA與標(biāo)靶基因接觸，使相應(yīng)的mRNA沉默。但是由于小蠊中腸中存在能夠分解dsRNA的液體[10]（以下簡稱中腸液），對(duì)剛進(jìn)入食道內(nèi)的dsRNA及食物一道進(jìn)行分解，很難讓其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，因此采用一種能夠抗中腸液分解物質(zhì)-脂質(zhì)體將其包裹，其進(jìn)入食道，避免被分解，從小腸上皮細(xì)胞進(jìn)入，從而發(fā)揮作用，使mRNA沉默[10]。喂食裸露的和有脂質(zhì)體包裹的dsRNA，經(jīng)定量PCR檢測(cè)，喂食脂質(zhì)體包裹的dsRNA有比較高的表達(dá)，而喂食裸露的dsRNA幾乎完全被降解[10]。

3 結(jié)語和展望