黃連提取物對(duì)TGEV的體外抑制效果

朱買勛，唐紅梅，陳春林，閆志強(qiáng)，曹 政

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一種接觸性傳染病。該病傳播方式廣，能通過(guò)污染的飼料、圈舍、糞便、病豬的接觸等途徑傳播；易感動(dòng)物群體多，能在各種日齡段豬群間暴發(fā)，尤其是斷奶前仔豬，多以相對(duì)密集型飼養(yǎng)，極易形成大規(guī)模暴發(fā)；傳播速度快，豬群一旦感染豬傳染性胃腸炎，會(huì)經(jīng)過(guò)各種途徑在豬群間迅速傳播，病毒在動(dòng)物體內(nèi)繁殖形成大規(guī)模的感染；致病性強(qiáng)，病毒入侵仔豬后，迅速破壞仔豬胃腸道菌群和黏膜組織結(jié)構(gòu)，仔豬表現(xiàn)出嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀，發(fā)病率高達(dá)到87.97%，病死率達(dá)到89.90%[1-2]；防治效果差，目前無(wú)特效治療藥物，主要是通過(guò)增強(qiáng)免疫和對(duì)癥治療的藥物對(duì)豬群進(jìn)行防治，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，2019年被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office international des epizooties，OIE)列為烈性傳染病[3]。面對(duì)臨床中TGEV致使的較大危害和經(jīng)濟(jì)損失，開發(fā)能夠高效防治的藥物是應(yīng)對(duì)該問(wèn)題的主要措施。根據(jù)TGEV主要寄生于宿主細(xì)胞的生物學(xué)特性，開發(fā)防治TGEV的理想藥物應(yīng)對(duì)病毒呈選擇性抑制作用，穿入細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞無(wú)損害作用。因此，本試驗(yàn)根據(jù)TGEV致使豬的臨床變化，選擇具有抗菌、抗病毒、抗腹瀉、抗氧化、抗?jié)兊茸饔霉πУ闹兴廃S連進(jìn)行提取制備成黃連提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)，在朱買勛等[4-5]前期研究的連梅提取物能有效防治仔豬濕熱瀉痢，防治TGEV為陽(yáng)性的仔豬腹瀉的基礎(chǔ)上，著力于CRE抑制TGEV增殖、保護(hù)宿主細(xì)胞、激發(fā)宿主細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子的分泌等研究，明確CRE體外抑制TGEV的作用效果及其作用方式。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 豬腎細(xì)胞(PK-15)，中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心提供，編號(hào)：GDC061。傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)，購(gòu)于ATCC，編號(hào)：VR-763。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 黃連提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)由黃連經(jīng)過(guò)醇提，硫酸反應(yīng)，鹽酸沉淀，過(guò)濾，純化結(jié)晶制備而成。測(cè)定后鹽酸小檗堿含6.37%，黃連堿含3.03%，巴馬汀含 0.11%。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒(批號(hào)：0000197548)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：0000219081)、PCR Green Master Mix(批號(hào)：0000219579)、qPCR Master Mix(批號(hào)：0000213128)均購(gòu)于普洛麥格生物技術(shù)有限公司，BM2000 DNA Marker(批號(hào)：716382CC)、PRMI 1640(批號(hào)：0023016)、胎牛血清(批號(hào)：1528235)均購(gòu)于博邁德生物有限公司。

1.1.4 主要儀器 ABI Veriti 96梯度PRC儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；GBOX SYDR4/2752凝膠圖像分析儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-7C電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；ABI 7500熒光定量PRC儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；Avanti J-26 XP高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，德國(guó)艾本德股份公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 病毒TCID50的測(cè)定 采用 Reed-Muench法測(cè)定，將TGEV病毒液分別用細(xì)胞維持液(含2%血清的DMEM培養(yǎng)液)依次10倍稀釋成10-1，10-2，10-3，…，10-7共7個(gè)稀釋度。將各稀釋度病毒懸液接種100 μL于長(zhǎng)有單層細(xì)胞的96孔板，各設(shè)8個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2孵育2 h后吸取出病毒液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)維持液液，置于5%CO2、37 ℃孵育箱培養(yǎng)，每天觀察記錄細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)，連續(xù)觀察7 d，按Reed-Muench法計(jì)算病毒致半數(shù)細(xì)胞病變的滴度(TCID50)[6]。

TCID50=Anti{B+(50-小于50%抑制百分率)/(大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率)×C}

式中：B=lg大于50%抑制百分率；C=lg稀釋倍數(shù)。

1.2.2 CRE對(duì)PK-15細(xì)胞最大無(wú)毒濃度的測(cè)定 采用MTT檢測(cè)法，將細(xì)胞懸液稀釋成1×105個(gè)/mL接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長(zhǎng)滿單層后，加入含有CRE質(zhì)量濃度為10-1～10-8g/mL的維持液(血清濃度2%)，每孔100 μL，每個(gè)濃度重復(fù)6孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，72 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的吸光值(OD值)，計(jì)算PK-15細(xì)胞存活率，篩選出CRE對(duì)PK-15細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度。細(xì)胞存活率(%)=各濃度藥物組OD值/空白組OD值×100%。

1.2.3 CRE對(duì)TGEV感染PK-15細(xì)胞保護(hù)作用 將細(xì)胞懸液稀釋成1×105個(gè)/mL接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞豐度達(dá)到80%后，分別設(shè)置空白組、病毒組、藥物對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)組6孔，正常細(xì)胞對(duì)照組添加維持液200 μL作為對(duì)照；病毒組細(xì)胞添加100 μL的病毒液感作2 h后，添加維持液培養(yǎng)72 h作為病毒對(duì)照；藥物對(duì)照組添加最大無(wú)毒濃度的藥物200 μL作為藥物對(duì)照；試驗(yàn)1組先將病毒和終濃度為最大無(wú)毒濃度的藥物4 ℃作用2 h，再添加200 μL至細(xì)胞上培養(yǎng)72 h；試驗(yàn)2組細(xì)胞先感染病毒2 h后，棄病毒液，添加終濃度為最大無(wú)毒濃度的維持液200 μL培養(yǎng)72 h；試驗(yàn)3組細(xì)胞先添加終濃度為最大無(wú)毒濃度的藥物200 μL作用48 h，再添加病毒100 μL感染2 h，棄病毒液，添加維持液200 μL培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)結(jié)束后各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，避光添加MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，添加50 μL的二甲基亞砜，充分混勻溶解后，570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，計(jì)算PK-15細(xì)胞活率。

1.2.4 CRE對(duì)TGEV增殖抑制 同“1.2.3”進(jìn)行分組和試驗(yàn)處理，試驗(yàn)結(jié)束后，提取病毒RNA，電泳檢測(cè)總RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照表1中TGEV引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)TGEV轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性 45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。

1.2.5 細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子的調(diào)節(jié) 同“1.2.3”進(jìn)行分組和試驗(yàn)處理，試驗(yàn)結(jié)束后，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)相關(guān)因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3的表達(dá)量變化。參照表1中引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3基因的轉(zhuǎn)錄水平。參照表1中各基因引物進(jìn)性RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)體系 25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性 45 s，各基因參照表1退火溫度設(shè)置，退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。

表1 用于分析豬相關(guān)基因的引物序列 Table 1 Primer sequence for analysis of pig-related genes

表2 TGEV感染PK-15細(xì)胞結(jié)果Table 2 TCID50 results of PK-15 cells infected with TGEV

1.2.6 數(shù)據(jù)分析及處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行收集，SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。RT-PCR結(jié)果中基因表達(dá)強(qiáng)度分別以絕對(duì)拷貝數(shù)/β-actin絕對(duì)拷貝數(shù)表示。將病毒組的表達(dá)量設(shè)置為1×，計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)于正常組的表達(dá)變化水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒滴度測(cè)定

TGEV病毒液經(jīng)感染細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)出能使細(xì)胞發(fā)生病變的數(shù)量，按Reed-Muench法計(jì)算出TGEV的TCID50為10-3.6/100 μL 稀釋的病毒液(表2)。

2.2 CRE對(duì)PK-15細(xì)胞最大無(wú)毒質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

從表3可知，黃連提取物質(zhì)量濃度1×10-1g/L時(shí)，由于高質(zhì)量濃度的藥物穿透進(jìn)入細(xì)胞后再細(xì)胞內(nèi)進(jìn)性殘留，影響測(cè)定的吸光值；質(zhì)量濃度為1×10-2g/L組的細(xì)胞存活率低至25.49%，極顯著低于1×10-4g/L以后的劑量組和空白組(P<0.01)；質(zhì)量濃度為1×10-3g/L組的細(xì)胞存活率低至 57.22%，顯著低于1×10-4g/L以后的劑量組和空白組(P<0.05)；質(zhì)量濃度為1×10-4g/L組，細(xì)胞存活率達(dá)到93.39%以上，之后的質(zhì)量濃度組間差異不顯著(P>0.05)，確定黃連提取物的最大無(wú)毒質(zhì)量濃度為1×10-4g/L。

表3 不同濃度的CRE對(duì)PK-15細(xì)胞的毒性Table 3 Toxic effects of different concentrations of CRE on PK-15 cells

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different uppercase letters in the same column indicate that difference is extremely significant(P<0.01), and the lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same below.

2.3 CRE對(duì)TGEV感染PK-15細(xì)胞存活率的 影響

從圖1可見，空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈鋪石路樣；接種TGEV病毒后病毒組大部分細(xì)胞出現(xiàn)拉絲鋪網(wǎng)和死亡等現(xiàn)象，細(xì)胞存活率極顯著低于空白組和其他試驗(yàn)組(P<0.01)；藥物對(duì)照組保持較高的細(xì)胞存活率，與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)1組的細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)典型的拉絲鋪網(wǎng)現(xiàn)象，但細(xì)胞存活率只達(dá)到 54.12%，極顯著低于空白組和試驗(yàn)3組(P< 0.01)；試驗(yàn)2組大量的細(xì)胞出現(xiàn)病變和死亡，細(xì)胞存活率極顯著低于空白組和試驗(yàn)2組(P<0.01)；試驗(yàn)3組細(xì)胞極少出現(xiàn)病變，細(xì)胞存活率達(dá)到 87.67%，極顯著高于試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和病毒組(表4，P<0.01)。

A.空白對(duì)照組；B.病毒組；C.藥物對(duì)照組；D.試驗(yàn)1組；E.試驗(yàn)2組；F.試驗(yàn)3組

表4 TGEV感染后PK-15細(xì)胞存活率Table 4 PK-15 cells viability after TGEV infection

2.4 CRE對(duì)TGEV增殖抑制效果

從圖2可知，空白組和藥物對(duì)照組2個(gè)未感染TGEV的細(xì)胞病毒檢測(cè)為陰性，經(jīng)CRE作用后，3個(gè)試驗(yàn)組病毒轉(zhuǎn)錄倍數(shù)分別降為病毒組的0.438、0.603、0.264倍，并出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，其中試驗(yàn)3組TGEV轉(zhuǎn)錄倍數(shù)顯著低于試驗(yàn)2組(P<0.05)；試驗(yàn)1組低于試驗(yàn)2組，試驗(yàn)3組低于試驗(yàn)1組，但差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明CRE經(jīng)過(guò)3種方式均可以抑制TGEV的 增殖。

2.5 CRE對(duì)細(xì)胞抗病因子轉(zhuǎn)錄的影響

從圖3可知，IFN-α基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果：病毒組細(xì)胞IFN-α基因的轉(zhuǎn)錄量升高，但與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組細(xì)胞IFN-α基因的轉(zhuǎn)錄量分別為病毒組的7.13倍、4.35倍、8.51倍，3個(gè)試驗(yàn)組均極顯著高于空白組、病毒組和藥物對(duì)照組(P< 0.01)，且試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組極顯著高于試驗(yàn)2組(P< 0.01)，試驗(yàn)3組顯著高于試驗(yàn)1組(P< 0.05)。

IFN-β基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果：病毒組、藥物對(duì)照組、空白組間細(xì)胞IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄量間差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組細(xì)胞IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄量分別為病毒組的3.34倍、 3.31倍、5.98倍，3個(gè)試驗(yàn)組均極顯著高于空白組、病毒組和藥物對(duì)照組(P<0.01)，且試驗(yàn)3組極顯著高于試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組(P<0.01)。

IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果：病毒組與空白組間細(xì)胞IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄量差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組、藥物對(duì)照組細(xì)胞IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄量分別為病毒組的2.28倍、 2.00倍、3.01倍、1.89倍，其中試驗(yàn)3組顯著高于試驗(yàn)1組(P<0.05)，極顯著高于試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組、藥物對(duì)照組、病毒組和空白組有(P< 0.01)；試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和藥物對(duì)照組顯著高于空白組(P<0.05)，極顯著高于病毒組(P<0.01)。

IRF-3基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果：病毒組細(xì)胞IRF-3基因的轉(zhuǎn)錄量低于空白組，但差異不顯著(P> 0.05)；試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組、藥物對(duì)照組細(xì)胞IRF-3基因的轉(zhuǎn)錄量分別為病毒組的 50.63倍、43.49倍、55.74倍、39.94倍，均極顯著高于空白組、病毒組(P<0.01)，且試驗(yàn)3組顯著高于試驗(yàn)2組和藥物對(duì)照組(P<0.05)。

“+”表示添加，“1+”和“2+”分別表示添加的順序，“1+”為先添加，“2+”表示后添加；柱標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

“+” indicates addition, “1+” and “2+” indicate order of addition, respectively, “1+” added first, “2+” added；different uppercase letters in the column indicate that difference is extremely significantP<0.01, and the lowercase letters indicate that the difference is significantP<0.05; the same below

圖2 CRE對(duì)TGEV增殖抑制
Fig.2 CRE inhibition on TGEV proliferation

圖3 黃連提取物作用后細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄變化Fig.3 Transcriptional changes of factors related to cellular antiviral after action of Coptidis Rhizoma extract

3 討 論

TGEV在感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，病毒與細(xì)胞膜上氨肽酶受體(pAPN)的識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合，并吸附在細(xì)胞膜表面，在內(nèi)吞和細(xì)胞融合作用下侵入宿主細(xì)胞胞漿內(nèi)，啟動(dòng)繁殖周期，促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖[7-8]。試驗(yàn)中，通過(guò)3種不同方式感染病毒和添加藥物，試驗(yàn)結(jié)果也出現(xiàn)明顯差異，其中先感染病毒在添加藥物作用組的PK-15細(xì)胞大量出現(xiàn)死亡，有明顯的CPE，細(xì)胞存活率達(dá)到40.69%，說(shuō)明細(xì)胞受到TGEV入侵后造成了大量的細(xì)胞損傷；病毒和藥物作用后，同時(shí)感染細(xì)胞組的細(xì)胞得到了一定的緩解，CPE明顯減少，細(xì)胞存活率達(dá)到54.12%，其原因可能是藥物直接與病毒接觸后，直接起到滅活病毒的作用，降低病毒的感染能力，也有可能是藥物同時(shí)作用于細(xì)胞后，保護(hù)細(xì)胞免受TGEV入侵，降低其損傷；先添加藥物作用后再感染病毒，細(xì)胞存活率達(dá)到 87.67%，TGEV造成的細(xì)胞損傷和病變明顯降低，可能是添加藥物作用后可以有效刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒相關(guān)物質(zhì)，有效抵御TGEV入侵來(lái)達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的效果。同時(shí)檢測(cè)不同方式作用后TGEV N基因的轉(zhuǎn)錄變化，3種不同的作用方式TGEV N基因的轉(zhuǎn)錄也存在著顯著差異，試驗(yàn)3組<試驗(yàn)1組<試驗(yàn)2組，結(jié)果顯示試驗(yàn)3組的給藥方式效果最佳。由此可以表明藥物添加的順序?qū)Φ钟鵗GEV感染有明顯的作用效果，充分體現(xiàn)出黃連提取物主要是以預(yù)防的方式對(duì)TGEV進(jìn)性防治。

在抗病毒過(guò)程中，激發(fā)細(xì)胞分泌抗病毒相關(guān)因子是抵御病毒的有效途徑。細(xì)胞在受到病毒的持續(xù)刺激后可促使干擾素通過(guò)自分泌和旁分泌作用產(chǎn)生，與同源性細(xì)胞表面受體結(jié)合形成干擾素-受體復(fù)合物而發(fā)揮其生物學(xué)作用[9]。病毒刺激后，PK-15細(xì)胞中只有IFN-α轉(zhuǎn)錄量有升高趨勢(shì)，激發(fā)細(xì)胞抗病毒的作用，但與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明細(xì)胞自身分泌的IFN-α不足與達(dá)到有效抑制TGEV的作用。在藥物刺激后，IFN-β、IFN-γ、IRF-3轉(zhuǎn)錄量升高，IFN-γ顯著高于空白組(P<0.05)，極顯著高于病毒組 (P<0.01)；IRF-3極顯著高于空白組和病毒組 (P<0.01)，顯示黃連提取物可以促使PK-15細(xì)胞分泌一些抗病毒相關(guān)因子。通過(guò)對(duì)3中不同方式進(jìn)行作用后，IFN-α、IFN-β、IRF-3轉(zhuǎn)錄量極顯著高于空白組、病毒組和藥物對(duì)照組(P<0.01)，IFN-γ也顯著(P<0.05)或者極顯著高于空白組和病毒組(P<0.01)。其中IFN-α可以通過(guò)增強(qiáng)免疫對(duì)病毒感染細(xì)胞的免疫殺傷活性，也可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞毒活性來(lái)參與抗病毒作用[10]。IFN-β也主要是參與抗病毒、抗腫瘤作用，其作用方式與IFN-α相似。IFN-γ在參與抗病毒的同時(shí)，還參與了部分的免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)rRNA合成，促使細(xì)胞內(nèi)的抗原如病毒肽遞呈給輔助性T細(xì)胞，調(diào)節(jié)K細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能活性[11-12]。激活表達(dá)高水平的誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶，進(jìn)而催化精氨酸產(chǎn)生的一氧化氮直接殺傷或產(chǎn)生過(guò)氧亞硝酸鹽殺傷病毒[12]。IRF-3能結(jié)合并活化干擾素α的啟動(dòng)子，啟動(dòng)IFN-α的表達(dá)，通過(guò)IRF-3的病毒誘導(dǎo)活化而使IFN-β基因表達(dá)[13]。同時(shí)，IRF-3還參與DNA的損傷修復(fù)，抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到抗病毒效果[14]。因此，可以推測(cè)3個(gè)試驗(yàn)中，先添加藥物刺激后會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定量的細(xì)胞因子，在受到病毒入侵后，細(xì)胞崩解導(dǎo)致抗病毒相關(guān)細(xì)胞因子擴(kuò)散到細(xì)胞間隙，增強(qiáng)抗病毒效果。