吳茱萸生物堿多指標(biāo)優(yōu)化提取新方法的探索

龔乃超，鎖進(jìn)猛，李夢(mèng)婷，張浩，樂(lè)薇

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430065）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎 Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa（Juss.）的干燥近成熟果實(shí)。常用于治療厥陰頭痛、寒病腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、院腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等，外治口瘡，高血壓癥[1]。藥理研究表明，生物堿類和苦味素類是吳茱萸的主要活性成分[2-4]，目前吳茱萸堿與次堿提取的方法有炮制法[5]、回流法、索氏提取法、超聲波提取法[6-9]、微波提取技術(shù)[10-12]、超臨界流體萃取[13]等方法。傳統(tǒng)的溶劑提取法存在能耗高、周期長(zhǎng)、工序多、收率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大，高溫破壞熱敏性成分等不足。隨著工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，傳統(tǒng)提取技術(shù)的種種缺陷，越來(lái)越制約了人們對(duì)中藥資源的開(kāi)發(fā)利用。內(nèi)部沸騰法是韋藤幼等[14]提出的一種強(qiáng)化提取過(guò)程的新方法，具有提取溫度低、速度快、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，對(duì)提取熱敏性物質(zhì)更具有優(yōu)勢(shì)，在中藥提取和天然化學(xué)成分研究等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[15]，將為中藥研究開(kāi)辟一個(gè)新的途徑以及中藥復(fù)方的提取工藝研究帶來(lái)極大的便利，但將其應(yīng)用于中藥方劑的提取僅剛剛開(kāi)始，創(chuàng)新研究的空間和前景很大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吳茱萸：江西省宜春市國(guó)苑中藥材有限公司；吳茱萸堿、吳茱萸次堿（標(biāo)準(zhǔn)品/100801001）：天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-50E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SP752型紫外分光光度器：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；AUY120電子天平：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定吳茱萸堿與次堿的含量

基于文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道的雙波長(zhǎng)分光光度法的測(cè)定原理，提出了利用雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法，該法首先測(cè)定提取液溶液在224、344 nm處的吸光度值，利用聯(lián)合方程同時(shí)求解出吳茱萸堿與次堿濃度。

聯(lián)合方程如下：

按照上式計(jì)算得出吳茱萸堿與次堿濃度，代入下式計(jì)算得率：

式中：c為吳茱萸堿或次堿濃度的濃度，（μg/mL）；m為吳茱萸粉末的質(zhì)量，g；V為定容的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；δ 為質(zhì)量轉(zhuǎn)換單位，（δ=1.0×106）。

1.3.2 超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法

1）采取少量乙醇溶液潤(rùn)濕吳茱萸粉末于30℃下超聲波一段時(shí)間，以使吳茱萸堿與次堿與能被充分解吸。

2）解吸后再取一定量30℃的水，將其置于精密恒溫水浴槽中，并迅速減壓到某一壓力下，使物料內(nèi)部有少量氣泡連續(xù)冒出，提取一段時(shí)間。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取解吸劑用量（A）、解吸時(shí)間（B）、操作壓力（C）與減壓時(shí)間（D）進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素表Table 1 Factors orthogonal test table

1.3.4 其他方法提取吳茱萸堿與次堿

采用其他提取方法分別對(duì)吳茱萸堿與次堿進(jìn)行提取，并利用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定提取液中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量。以吳茱萸堿與次堿得率為考察指標(biāo)，將本法與傳統(tǒng)熱炮制提取法、超聲提取法、微波提取法相比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

吳茱萸堿和吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 吳茱萸堿與吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品的UV光譜圖Fig.1 Evodiamine and rutecarpine standard ultraviolet-visible spectra

由圖1可知，吳茱萸堿在224 nm處有最強(qiáng)吸收峰，吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品在215 nm和344 nm有最強(qiáng)吸收峰，215 nm處為二氫吲哚堿類的紫外吸收帶[19]，因此，在進(jìn)行雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定吳茱萸堿與次堿含量時(shí)，選擇224 nm與344 nm。

2.2 吳茱萸堿與次堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取吳茱萸堿和次堿對(duì)照品2.5 mg，用無(wú)水乙醇配成50 μg/mL的吳茱萸堿母液。分別準(zhǔn)確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 吳茱萸堿母液，用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶。分別在吳茱萸堿和次堿最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制吳茱萸堿和次堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 吳茱萸堿、次堿含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Evodiamine and rutecarpine content determination of standard curve

2.3 超聲解吸過(guò)程對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.3.1 解吸劑濃度對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取吳茱萸1.00g，按照1.3.2方法提取吳茱萸堿與次堿，并測(cè)其得率（下同），解吸劑濃度對(duì)吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖3所示。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，吳茱萸堿與次堿的得率也隨之增加，80%的乙醇對(duì)植物細(xì)胞具有最大的滲透和解吸能力，所以本試驗(yàn)選擇80%的乙醇作為最佳解吸劑濃度。

圖3 解吸劑濃度對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.3 Fesorption agent concentration of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.3.2 解吸劑用量對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

解吸劑用量對(duì)吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖4所示。

圖4 解吸劑用量對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.4 Desorption agent of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由圖4可知，隨著解吸劑用量的增多，吳茱萸堿與次堿提取得率也隨之增加，當(dāng)解吸劑用量增加到5 mL/g時(shí)，提取得率基本已趨于平緩。這是由于解吸劑用量太少時(shí)，乙醇解吸植物細(xì)胞不夠充分，提取活性成分少，當(dāng)解吸劑用量已足夠潤(rùn)濕物料，解吸基本達(dá)到飽和時(shí)，如再繼續(xù)增加解吸劑用量是不經(jīng)濟(jì)的，所以本試驗(yàn)選擇5 mL/g作為解吸劑用量。

2.3.3 解吸時(shí)間對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

超聲解吸時(shí)間對(duì)吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著超聲解吸時(shí)間的增多，吳茱萸堿與次堿提取得率也增加，當(dāng)超聲解吸時(shí)間增加到20 min時(shí)，提取得率達(dá)到最大。當(dāng)超聲解吸時(shí)間20 min時(shí)，提取率下降。隨著超聲解吸時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波的作用也相應(yīng)加強(qiáng)，吳茱萸堿與次堿浸出量增加，但超聲波的空化作用也能使其他物質(zhì)浸出，提取過(guò)程中吳茱萸堿與次堿和其他物質(zhì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，所以提取時(shí)間大于20 min時(shí)吳茱萸堿與吳茱萸次堿的提取率下降，所以本試驗(yàn)選擇20 min作為超聲解吸劑時(shí)間。

圖5 超聲解吸時(shí)間對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.5 Ultrasonic desorption time of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.4 減壓提取過(guò)程對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.4.1 操作壓力對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

操作壓力對(duì)吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖6所示。

圖6 操作壓力對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.6 Operating pressure of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由圖6可以看出，操作壓力過(guò)低時(shí)滲透到內(nèi)部的乙醇達(dá)不到沸騰的要求，而壓力過(guò)高時(shí)沸騰汽化劇烈，因此壓力過(guò)低或過(guò)高都不適合吳茱萸堿與次堿的提取，當(dāng)操作壓力為0.04 MPa（絕對(duì)壓力）為最適提取條件。這主要是由于解吸過(guò)程中，滲透到植物細(xì)胞內(nèi)部的乙醇，在該提取壓力下沸騰效果最好，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。所以本試驗(yàn)選擇0.04 MPa作為減壓操作的工作壓力。

2.4.2 減壓時(shí)間對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

減壓時(shí)間對(duì)吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖7所示。

由圖7可知，隨著減壓時(shí)間的增加，吳茱萸堿與次堿的提取得率在逐漸增大，在5 min時(shí)達(dá)到最高，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吳茱萸堿與次堿的提取得率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)?？赡苁菚r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，引起乙醇沸騰汽化劇烈進(jìn)而使吳茱萸堿與次堿的提取得率降低，所以本試驗(yàn)選擇5 min作為減壓操作的工作時(shí)間。

圖7 減壓時(shí)間對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.7 Decompression time of evodiamine and the influence of rutecarpine extraction yield

2.5 正交試驗(yàn)對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.5.1 吳茱萸堿與次堿提取條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究解吸劑用量（A）、解吸時(shí)間（B）、操作壓力（C）與減壓時(shí)間（D）4個(gè)因素對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響進(jìn)行考察，以確定超聲波聯(lián)合減壓-內(nèi)部沸騰法最佳提取工藝條件。本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)，以吳茱萸堿與次堿提取得率為指標(biāo)進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 吳茱萸堿與次堿正交試驗(yàn)方案及極差分析結(jié)果Table 2 Evodiamine and rutecarpine orthogonal test and extreme difference analysis results

由表2中極差R來(lái)看，正交試驗(yàn)所考察的4個(gè)因素對(duì)吳茱萸堿與次堿提取得率的影響基本一致，各因素對(duì)吳茱萸堿提取得率的影響較顯著，4個(gè)因素對(duì)吳茱萸堿得率的影響程度為B＞A＞D＞C，即解吸時(shí)間＞解吸劑用量＞減壓時(shí)間＞操作壓力，最佳的提取工藝為A3B2C1D3，即在解吸劑用量 6 mL、解吸時(shí)間 20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時(shí)間6 min時(shí)吳茱萸堿與次堿提取得率最高。

2.5.2 正交試驗(yàn)方差分析

取各列偏差平方和中最小的近似當(dāng)作誤差的估計(jì)，選用因素C操作壓力為誤差估計(jì)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3與表4。

表3 吳茱萸堿正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Evodiamine orthogonal test the result of variance analysis

表4 吳茱萸次堿正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Rutecarpine orthogonal test the results of variance analysis

由方差分析結(jié)果可知，因素A、B、D，即解吸劑用量、解吸時(shí)間、減壓時(shí)間對(duì)吳茱萸堿提取得率的影響要大于對(duì)吳茱萸次堿提取得率的影響，且解吸劑用量、解吸時(shí)間對(duì)結(jié)果影響較為顯著，與極差分析結(jié)果基本一致。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)結(jié)果最佳工藝條件下，即解吸劑用量6 mL、解吸時(shí)間20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時(shí)間6 min條件下時(shí)，吳茱萸堿與次堿的提取率最大，并與傳統(tǒng)炮制提取法、超聲波提取法及微波提取法相比較，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)與其他最佳提取方法Table 5 Validation testing and other best extraction method

結(jié)果顯示超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法提取得率明顯高于傳統(tǒng)炮制提取法、超聲波提取法及微波提取法，超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法提取時(shí)間縮短1/2、乙醇溶劑用量減少80%，反應(yīng)條件溫和，提取過(guò)程危險(xiǎn)性大大降低。

3 結(jié)論

超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取中藥吳茱萸在解吸劑用量6 mL、解吸時(shí)間20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時(shí)間6 min的條件下，吳茱萸堿的得率為2.54%，吳茱萸次堿的得率為0.87%。與炮制提取法0.72%、0.34%，超聲波提取法1.29%、0.52%，微波提取法0.92%、0.37%相比超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取溫度低、速度快、溶劑消耗量少，大大提高了提取生產(chǎn)過(guò)程的安全性，所得提取液質(zhì)量高。超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法用于提取吳茱萸生物堿優(yōu)勢(shì)明顯。綜上所述，超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取為吳茱萸藥材的較佳提取方法。