陳航宇 ，劉 鶴，婁婷婷，何 蕊，賀丹彤，劉 睿，位 鴻*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

穿山龍是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，主要含有多種甾體皂苷類(lèi)成分，有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[1]，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)從穿山龍中分離的甲基原薯蕷皂苷，具有很強(qiáng)的抗癌活性，是一個(gè)開(kāi)發(fā)前景良好的抗癌新藥侯選化合物。

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)是在傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展起來(lái)的新型技術(shù)手段。應(yīng)用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度、水分等條件下對(duì)藥物進(jìn)行發(fā)酵，微生物產(chǎn)生的酶，可以使中藥中的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)得到修飾，改變其原有的特性，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的藥效，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，以滿(mǎn)足臨床用藥[2]。

本實(shí)驗(yàn)的前期工作，以梗孢科曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）為菌種，采用固體發(fā)酵技術(shù)，對(duì)穿山龍藥材進(jìn)行發(fā)酵研究，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生了新的呋甾皂苷，本實(shí)驗(yàn)將穿山龍藥材以及發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取和純化，制成了總皂苷提取物，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)其抗腫瘤活性及其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料、試劑及儀器

1.1 主要材料 原材料：穿山龍藥材總皂苷（實(shí)驗(yàn)室自制；紫外分光光度法檢測(cè)含量為128.72 mg/g）10 g；穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷（實(shí)驗(yàn)室自制；紫外分光光度法檢測(cè)含量為133.67 mg/g）10 g。

1.2 試劑 MTT 購(gòu)自Thiazoly 公司；BCA 試劑盒購(gòu)于碧云天生物制劑公司；Bcl-2、Bax、caspase3、Tublin抗體購(gòu)于Abcam 公司。

1.3 主要儀器 BT125D 電子分析天平為賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)Fascs Aria Ⅱ）購(gòu)于美國(guó)BD 公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（型號(hào)Infinit 200 pro）購(gòu)于瑞士TEC 公司。

1.4 細(xì)胞株 人肝腫瘤細(xì)胞（HepG2）細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 穿山龍?jiān)碥盏奶崛?/p>

2.1.1 提取方法 通過(guò)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及綜合文獻(xiàn)[3]，確定了提取穿山龍中皂苷的方法為8 倍量70%乙醇回流提取，每次2 h。

2.1.2 提取工藝 分別稱(chēng)取穿山龍藥材以及穿山龍米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)物100 g，按照2.1.1 項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取，濃縮至適宜濃度備用。

2.2 穿山龍總皂苷的純化 取穿山龍藥材以及穿山龍米曲霉固體發(fā)酵物皂苷提取液用D101 大孔樹(shù)脂純化[4]，用75%乙醇洗脫至洗脫液無(wú)色，收集洗脫液，減壓濃縮蒸干備用。

2.3 抗腫瘤活性研究

2.3.1 MTT 實(shí)驗(yàn) 將HepG2 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞3 復(fù)孔，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL穿山龍總皂苷溶液（穿山龍）和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液（發(fā)酵物）培養(yǎng)，24 h 后每孔加入10 μL MTT，4 h 后吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻30 s，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）值。對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，計(jì)算其余各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組平均A 值/對(duì)照組平均A 值）×100%。

2.3.2 Annexin V/PI 雙染法 將對(duì)數(shù)期HepG2 細(xì)胞胰酶消化后收集，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重懸后，接種于6 孔板。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，向每孔分別加入濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞重懸于PBS洗滌兩次。用50 μL Annexin V 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液中加入3 μL Annexin V-FITC 染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，加入6 μL PI 染色液后輕輕混勻室溫避光孵育5 min。加入450 μL Annexin V 結(jié)合液，終止染色并立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.3.3 Western blotting 各組細(xì)胞藥物作用24 h 后，用胰酶消化收集細(xì)胞，在RIPA 緩沖液中超聲裂解，然后在4℃、10 000 r 下離心15 min，然后用BCA試劑來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。等量的蛋白通過(guò)12%的SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶阻斷1 h 后，加入合適濃度的一抗4℃過(guò)夜，一抗分別為Bcl-2、Bax、Caspase3 和內(nèi)參Tublin，TBST 洗3 次。然后再與標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，ECL 顯影。利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集及蛋白灰度定量。蛋白表達(dá)水平=每個(gè)樣本條帶灰度值/Tublin 灰度值。用于測(cè)定HepG2 細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 的蛋白表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 MTT 法檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用MTT 法對(duì)不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，與空白對(duì)照組比較，進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可見(jiàn)，細(xì)胞存活率有所下降，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，即濃度越大細(xì)胞存活率越低。

3.2 Annexin V/PI 雙染色結(jié)果 鏡下觀察，分別加入不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液24 h 后，如圖2 與control 組比較可以看到12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 濃度細(xì)胞明顯死亡，且死亡細(xì)胞遞增。50 μg/mL 濃度細(xì)胞死亡非常嚴(yán)重，更多的細(xì)胞變圓，細(xì)胞貼壁狀態(tài)差，懸浮于培養(yǎng)基。如圖3 進(jìn)一步根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)圖譜可以看出6.25～50 μg/mL不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液均可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡（P＜0.001），凋亡比例明顯呈濃度依賴(lài)性的升高。

3.3 Western blotting 結(jié)果 通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)圖像采集及蛋白灰度定量分析，如圖4，Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液處理的HepG2 細(xì)胞，與空白對(duì)照組比較，Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。

圖1 各組細(xì)胞存活率比較

圖3 流式細(xì)胞術(shù)圖譜

圖4 不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷溶液對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

在本研究中，使用米曲霉對(duì)穿山龍藥材進(jìn)行固體發(fā)酵，采用70%乙醇回流法對(duì)藥材以及發(fā)酵物總皂苷進(jìn)行提取，D101 樹(shù)脂純化，制成了穿山龍總皂苷和穿山龍米曲霉發(fā)酵物總皂苷，并采用 MTT 比色法和雙熒光染色法研究其體外抗腫瘤活性，探索發(fā)酵對(duì)穿山龍藥材抗腫瘤活性的影響。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，二者均可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，凋亡比例明顯呈濃度依賴(lài)性的升高，表明發(fā)酵物具有同藥材相近的抗腫瘤效果，進(jìn)一步通過(guò)Western blot 對(duì)HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，研究了其抗腫瘤機(jī)制。

Bcl-2 家族蛋白在健康和疾病之間調(diào)節(jié)著細(xì)胞生存和死亡的臨界平衡[5-6]，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體通透性[7]，Bax是bcl-2 蛋白家族中一個(gè)促凋亡的成員，它們是使細(xì)胞凋亡以及癌癥的治療靶點(diǎn)[8]在活細(xì)胞中，bax 和bak(bax/bak)的激活直接受到bcl-2 家族成員的抑制[9]。caspase-3 則是一種主要的凋亡執(zhí)行者，在大多數(shù)凋亡事件中，caspase-3 的高度表達(dá)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果表明穿山龍藥材及其米曲霉發(fā)酵物對(duì)HepG2 細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用，其機(jī)制可能為上調(diào)caspase-3 的表達(dá)，對(duì)其上游bax 及bcl2 的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，可能藥物誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡不是通過(guò)這一通路，具體的抑癌途徑還需要進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)有效利用中藥穿山龍資源獲取藥用活性成分并研究其機(jī)制提供了前期科學(xué)依據(jù)。