雙氯芬酸鈉可溶微針在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

李瑩瑩,陳遠(yuǎn)政,趙偉曼,董智勇,徐雨靚,魏 芳,吳傳斌,王清清(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析教研室,蚌埠 33000;中山大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室;通訊作者,E-mail:qingqingwang@bbmc.edu.cn)

雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)是一種鎮(zhèn)痛解熱、非甾體類抗炎藥[1]。雙氯芬酸鈉化學(xué)名為2-[(2,6-二氯苯基)氨基]苯乙酸鈉,其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧合酶的活性以減少前列腺素的合成,此外還能抑制脂氧合酶,減少白三烯的生成。因此本品廣泛用于緩解輕至中度疼痛,治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉骨骼損傷等[2]。

可溶微針貼片是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型經(jīng)皮給藥制劑,近年來(lái)受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[3]?？扇芪⑨樖怯伤苄圆牧虾退幬锘旌现瞥傻尼橀L(zhǎng)在25-2 000 μm的實(shí)心針,微針刺入皮膚后可自行降解,且能夠在皮膚表面形成藥物傳遞的通道,還可以通過(guò)調(diào)節(jié)針長(zhǎng),避開(kāi)神經(jīng)末梢和毛細(xì)血管豐富的真皮層,減少或消除疼痛與感染[4,5]?？扇芪⑨樫N片不僅避免了口服制劑的首過(guò)效應(yīng),還具有注射給藥的高效性和準(zhǔn)確性,同時(shí)還具有經(jīng)皮給藥的順應(yīng)性和方便性。

雙氯芬酸鈉大多為口服制劑,吸收迅速,解熱鎮(zhèn)痛作用較阿斯匹林強(qiáng)25-50倍,比布洛芬強(qiáng)8倍,經(jīng)尿液和膽汁代謝排泄[6]。但其對(duì)胃腸道刺激性大[7],易導(dǎo)致上腹不適,胃腸出血甚至穿孔,且首過(guò)消除較為嚴(yán)重,生物利用度只有50%,血漿半衰期短,僅1.1-1.8 h,每日需給藥3次,患者依從性差,并產(chǎn)生血藥濃度的“峰谷現(xiàn)象”[8,9]。若將雙氯芬酸鈉包載于可溶微針中經(jīng)皮給藥,則可直接應(yīng)用于靶部位,避免了藥物的首過(guò)效應(yīng),消除了嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng),同時(shí)可提高用藥順應(yīng)性,也可自由調(diào)節(jié)藥量,隨時(shí)停藥。

高效液相色譜法(HPLC)已被廣泛用于各種定性定量的分析研究[10],但少有報(bào)道利用可溶微針給藥并測(cè)定生物樣品中藥物的含量。本文旨在建立HPLC法測(cè)定可溶微針給藥后生物樣品中藥物含量的方法,并為相關(guān)微針制劑和今后臨床應(yīng)用提供可靠、準(zhǔn)確的檢測(cè)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(LC-16,島津儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-500B,昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(FA224,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);多管漩渦混合儀(HD-2500,杭州佑寧儀器有限公司);臺(tái)式高速離心機(jī)(Allegra X-22,貝克曼公司);純水儀(Advantage A10,Milli-Q公司)。

1.2 試藥

雙氯芬酸鈉可溶微針貼片(250 μg/片,本實(shí)驗(yàn)室自制);雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100334-201803,純度:100.0%);萘普生對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100198-200403);肝素(辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):1710216421);冰醋酸(天津大茂試劑廠,批號(hào):20181201);甲醇(TEDIA,色譜純);超純水。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),質(zhì)量合格證號(hào)為NO.201905766,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇)2017-0001,SPF級(jí),體質(zhì)量170-200 g。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-1.5%冰醋酸水溶液(80∶20);流速:1.0 ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μl。

1.4.2 溶液配制 精密稱取雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品和萘普生標(biāo)準(zhǔn)品,分別置于100 ml容量瓶中,均使用甲醇溶解并定容至刻度線,配制得到濃度為192.00 μg/ml的雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和29.00 μg/ml的萘普生內(nèi)標(biāo)液。

1.4.3 血漿樣品的前處理 精密吸取5 μl萘普生內(nèi)標(biāo)液(29 μg/ml)置于1.5 ml EP管中,加入50 μl血漿樣品,再加入100 μl甲醇,渦旋混合5 min后至于離心機(jī)中以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速,4 ℃離心10 min,取上清液,進(jìn)樣檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

取空白血漿、空白血漿加雙氯芬酸鈉和內(nèi)標(biāo)物以及可溶微針給藥后的血漿樣品,按照1.4.3項(xiàng)下方法處理,得到相應(yīng)的待測(cè)樣品,按1.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄相應(yīng)的色譜圖。結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)條件下雙氯芬酸鈉的保留時(shí)間約為8.10 min,內(nèi)標(biāo)物萘普生的保留時(shí)間約為5.50 min,樣品測(cè)定不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾,專屬性強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系考察

取上述雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液按0.20,0.40,1.00,2.00,3.00,4.00 μg/ml的濃度配制血漿樣品,按上述1.4.3項(xiàng)下方法處理樣品,并按1.4.1項(xiàng)下測(cè)定。以雙氯芬酸鈉的濃度為橫坐標(biāo),以樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=0.362 6X+0.047 4,R2=0.999 3。表明血漿藥物濃度在0.20-4.00 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.20 μg/ml。

圖1 雙氯芬酸鈉和萘普生在大鼠血漿中的HPLC圖Figure 1 The HPLC chromatograms of diclofenac sodium and naproxen in rat plasma

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

精密吸取空白血漿45 μl加入1.5 ml EP管中,加入雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制濃度為0.20,0.40,2.00,4.00 μg/ml的含藥血漿樣品。按1.4.3項(xiàng)下方法處理血漿樣品后按1.4.1項(xiàng)下條件注入高效液相色譜儀測(cè)定。每個(gè)濃度制備5個(gè)樣品,連續(xù)3 d進(jìn)行重復(fù)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,各濃度日內(nèi)準(zhǔn)確度在92.6%-98.9%之間,日內(nèi)精密度在3.7%-8.8%之間,日間準(zhǔn)確度在93.0%-103.4%之間,日間精密度在1.1%-5.0%之間。日內(nèi)、日間精密度的RSD值均<10.0%,準(zhǔn)確度均在85.0%-115.0%內(nèi),符合生物樣品檢測(cè)要求。

表1 血漿中雙氯芬酸鈉的精密度和準(zhǔn)確度 (n=5)Table 1 Precision and accuracy of diclofenac sodium in plasma (n=5)

2.4 提取回收率

精密吸取空白血漿45 μl,分別加入5 μl濃度為2.00,4.00,20.00,40.00 μg/ml的雙氯芬酸鈉儲(chǔ)備液,配制成雙氯芬酸鈉濃度為定量下限(0.20 μg/ml)、低(0.40 μg/ml)、中(2.00 μg/ml)、高(4.00 μg/ml)的含藥血漿樣品,再加入5 μl內(nèi)標(biāo)溶液(29.00 μg/ml),取處理后的各血漿供試品20 μl,按1.4.1項(xiàng)下方法注入高效液相色譜儀測(cè)定,記錄各峰面積之比為A。另取同樣的樣本,先用甲醇沉淀空白血漿后收集上清,然后配制成相同濃度的含藥血漿進(jìn)行檢測(cè),記錄峰面積之比為B。提取回收率=A/B×100.0%。結(jié)果顯示,各濃度的提取回收率分別為(94.1±9.5)%,(101.2±8.2)%,(105.4±9.5)%,(102.5±8.0)%;RSD分別為10.1%,8.1%,9.0%,7.8%(見(jiàn)表2),均滿足生物樣品測(cè)定的要求,說(shuō)明該方法的提取回收率較高。

2.5 樣品穩(wěn)定性考察

取空白血漿樣品加入雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備濃度為0.20,2.00,4.00 μg/ml的含藥血漿樣品,分別將樣品放置在常溫下儲(chǔ)存4 h、4 ℃儲(chǔ)存24 h、-20 ℃凍融循環(huán)3次和-20 ℃儲(chǔ)存7 d后,按照1.4.3項(xiàng)下方法處理后按1.4.1項(xiàng)下條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度樣品進(jìn)行5次樣本分析。結(jié)果顯示,各濃度在以上儲(chǔ)存條件下的檢測(cè)值相對(duì)于理論值分別在96.0%-104.5%,91.2%-105.0%和91.5%-106.1%之間波動(dòng),RSD均<10.0%(見(jiàn)表3),說(shuō)明樣品在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件下穩(wěn)定性好。

表2 血漿中雙氯芬酸鈉的提取回收率 (n=5)Table 2 Extraction recovery of diclofenac sodium in plasma (n=5)

表3 血漿中雙氯芬酸鈉的穩(wěn)定性 (n=5)Table 3 Stability of diclofenac sodium in plasma (n=5)

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 血漿樣品采集 取健康的雄性SD大鼠6只,耳部剃毛。每只大鼠耳部放置4片雙氯芬酸鈉可溶微針。分別于給藥后2 min,5 min,10 min,20 min,40 min,1 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h大鼠眼眶取血約0.3 ml,置于提前加入肝素的1.5 ml EP管中,4 ℃離心5 min(5 000 r/min)后取上層血漿,暫時(shí)保存在-20 ℃冰箱待測(cè)。

2.6.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 將可溶微針給藥后的各血漿樣品按1.4.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,按1.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶微針給藥后大鼠體內(nèi)雙氯芬酸鈉的血藥濃度,其血藥濃度-時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖2。經(jīng)Phoenix WinNonlin 6.4軟件分析得主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù),見(jiàn)表4。

圖2 大鼠雙氯芬酸鈉可溶微針給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線 (n=6)Figure 2 Drug concentration-time curve of diclofenac sodium dissolving microneedles in rats after administration (n=6)

表4 大鼠雙氯芬酸鈉可溶微針給藥后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (n=6)Table 4 The main pharmacokinetic parameters of diclofenac sodium dissolving microneedles in rats after administration (n=6)

Cl：清除率；MRT：平均滯留時(shí)間；Vd：表觀分布容積

3 討論

本研究采用HPLC法對(duì)SD大鼠血漿中雙氯芬酸鈉的濃度進(jìn)行了測(cè)定,以萘普生作為內(nèi)標(biāo),利用甲醇去除蛋白沉淀的方法處理血漿樣品,方法專屬性高,不受內(nèi)源性雜質(zhì)影響。中國(guó)藥典(2015版)收載的雙氯芬酸鈉高效液相色譜法以甲醇-4.0%冰醋酸溶液(70∶30)為流動(dòng)相,而文獻(xiàn)大多采用乙腈-乙酸鹽或磷酸鹽緩沖液等體系[11-13]。在建立方法學(xué)的過(guò)程中,本課題組對(duì)這些流動(dòng)相都進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)乙腈和磷酸鹽緩沖液為主要流動(dòng)相時(shí)分離效果并不理想,且乙腈的毒性較大。以甲醇-4.0%冰醋酸溶液為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)峰的峰形不好。本方法以甲醇-1.5%冰醋酸(80∶20)作為流動(dòng)相,峰形好、分離度高,而且甲醇毒性小、成本低,易沖洗。選取萘普生作為內(nèi)標(biāo)物,其色譜行為、色譜條件與待測(cè)物雙氯芬酸鈉較接近,且分離度較好,穩(wěn)定性好,信號(hào)強(qiáng)。此外,采用等度洗脫法對(duì)樣品進(jìn)行分析,目標(biāo)峰均出現(xiàn)在4.00 min之后,可以較好避免血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,同時(shí)又能夠顯著縮短樣品的分析周期,從而加快分析速度。有文獻(xiàn)報(bào)道雙氯芬酸鈉血漿樣品前處理方法為萃取法[14]和蛋白沉淀法[15,16]。萃取法首先酸化血漿樣品,之后用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取,其操作流程復(fù)雜,且萃取溶劑一般為乙醚、乙酸乙酯等毒性試劑。蛋白沉淀法與液液萃取法相比更為方便、安全,在滿足定量要求的同時(shí)大大減少了預(yù)處理時(shí)間,一定程度可以加快分析速度,提升效率。對(duì)于蛋白沉淀劑的選擇,考察了最常用的甲醇和乙腈,發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉的提取回收率均符合生物樣品的測(cè)定要求,鑒于甲醇較乙腈毒性小、成本低。因此本實(shí)驗(yàn)選取甲醇去除蛋白沉淀以處理血漿樣品。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雙氯芬酸鈉在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的研究,獲得可溶微針給藥的藥動(dòng)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該藥物的半衰期為(1.79±0.99)h,達(dá)峰時(shí)間為(0.21±0.10)h。本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定大鼠血漿中雙氯芬酸鈉的HPLC法,能夠滿足雙氯芬酸鈉藥動(dòng)學(xué)的研究,得到的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)為雙氯芬酸鈉可溶微針進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。