長(zhǎng)江上游中華金沙鰍和短身金沙鰍線粒體遺傳多樣性研究

龍安雨，田輝伍，汪登強(qiáng)，陳大慶，周湖海,3，段辛斌

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

長(zhǎng)江上游指宜昌以上江段，該江段地形地貌復(fù)雜、河流水系眾多，魚(yú)類(lèi)區(qū)系與物種組成具有多樣性、特有性特征，有魚(yú)類(lèi)200多種，其中特有魚(yú)類(lèi)100多種[1]。近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，該江段大型水利工程相繼建設(shè)，導(dǎo)致水文等環(huán)境條件發(fā)生改變，魚(yú)類(lèi)適宜生境不斷破碎、萎縮，種群數(shù)量急劇下降[1]，魚(yú)類(lèi)資源和遺傳多樣性保護(hù)已成為長(zhǎng)江上游水電開(kāi)發(fā)過(guò)程中受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

中華金沙鰍(Jinshaiasinensis)和短身金沙鰍(J.abbreviata)是長(zhǎng)江上游的特有魚(yú)類(lèi)，是金沙鰍屬僅有的兩個(gè)種[2]，其中中華金沙鰍也是“長(zhǎng)江上游珍稀特有魚(yú)類(lèi)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)”的保護(hù)對(duì)象之一[3]。兩種金沙鰍均為底棲、雜食性、喜激流、產(chǎn)漂流性卵魚(yú)類(lèi)，其生活類(lèi)型是長(zhǎng)江上游最主要的生態(tài)類(lèi)群，具有代表性。兩種金沙鰍不僅有相似的形態(tài)特征和生活習(xí)性，而且分布區(qū)域基本重疊，主要分布在長(zhǎng)江上游干流、金沙江、雅礱江、嘉陵江和岷江[2,4]等水域。但是在資源量上，中華金沙鰍和短身金沙鰍有明顯差別，根據(jù)魚(yú)類(lèi)早期資源調(diào)查，中華金沙鰍規(guī)模大于短身金沙鰍[4]，表明這兩種魚(yú)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力存在差異。因此研究群體遺傳多樣性有助于闡明近緣同域分布種類(lèi)的適應(yīng)性進(jìn)化。本研究采用線粒體DNA (mtDNA)控制區(qū)序列對(duì)長(zhǎng)江上游兩種金沙鰍遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在了解兩種金沙鰍的遺傳多樣性現(xiàn)狀，為長(zhǎng)江上游金沙鰍屬魚(yú)類(lèi)的資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016-2018年在長(zhǎng)江上游8個(gè)樣點(diǎn)采集中華金沙鰍136尾，3個(gè)樣點(diǎn)采集短身金沙鰍66尾。樣本采集地見(jiàn)圖1，樣本量見(jiàn)表1。所有樣本經(jīng)形態(tài)鑒定[2]后剪取少量鰭條并保存于無(wú)水乙醇中備用。

圖1 中華金沙鰍和短身金沙鰍采樣點(diǎn)及中華金沙鰍線粒體DNA控制區(qū)譜系分布Fig.1 Sampling sites and mtDNA clad distribution of J.sinensis and J.abbreviate

1.2 基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

采用高鹽法提取基因組DNA[5]。線粒體控制區(qū)PCR擴(kuò)增采用申紹祎等[6]研究所用引物。PCR的擴(kuò)增體系為50 μL，包含2×PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)25 μL，上下游引物(10 pmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水加至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR結(jié)束后，取2.5 μL產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR，將擴(kuò)增效果良好的PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用Lasergene v7.1軟件包中的SeqMan對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，Clustal X[7]軟件進(jìn)行對(duì)位排列。用 MEGA v6.0[8]分析軟件統(tǒng)計(jì)序列的平均堿基組成、計(jì)算轉(zhuǎn)換/顛換比率。在DnaSP v5.0[9]軟件中獲得單倍型數(shù)(H)、變異位點(diǎn)數(shù)(S)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)等參數(shù)，并計(jì)算群體間的K2P遺傳距離，。

應(yīng)用Arlequin v3.11[10]軟件計(jì)算群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)值，進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，設(shè)1 000次重復(fù)隨機(jī)抽樣作顯著性檢驗(yàn)。用公式Nm=(0.5/FST)-0.5計(jì)算群體間基因流[11]。在MEGA v6.0[7]分析軟件中構(gòu)建單倍型鄰接(NJ)發(fā)育樹(shù)，bootstrap驗(yàn)證各分支支持率，設(shè)置為1 000。同時(shí)采用MrBayes v 3.1.2[12]軟件對(duì)單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)行了貝葉斯推理(BI)，最佳堿基替換模型由在線軟件IQtree (http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)獲得。使用Network5.0程序[13]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析。

在DnaSP v5.0軟件中計(jì)算中性檢驗(yàn)值Tajima′s D和Fu′s Fs。用Beast 2.4.3.0[14]進(jìn)行Bayesian Skyline Plots (BSP)分析種群歷史，MCMC設(shè)為600 000 000，所得結(jié)果由TRACER ver.1.4 讀取，各項(xiàng)參數(shù)的ESS均大于200。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異

序列比對(duì)后共獲得中華金沙鰍136條控制區(qū)序列，有效序列長(zhǎng)度為915 bp，A、T、C、G的平均含量為35.63%、30.19%、20.02%和14.15%，具有明顯的反G含量?jī)A向，Ts/Tv =23.63，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)。共獲得66尾短身金沙鰍控制區(qū)序列，比對(duì)后得到有效長(zhǎng)度為908 bp，A、T、C、G的平均含量為35.82%、31.39%、19.49%和13.30%，Ts/Tv =12.87，轉(zhuǎn)換數(shù)也明顯高于顛換數(shù)。

中華金沙鰍序列中共發(fā)現(xiàn)132個(gè)變異位點(diǎn)，其中39個(gè)為單一突變位點(diǎn)，93個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。136條序列共定義了131個(gè)單倍型，其中頻率在2以上的單倍型只有5個(gè)，其余單倍型的頻率均為1?？倶颖竞塑账岫鄻有?Pi)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)分別為0.018 2和0.999(表1)，各群體之間的遺傳多樣性差別較小。短身金沙鰍序列僅檢測(cè)到2個(gè)變異位點(diǎn)，定義了3個(gè)單倍型，Pi和Hd分別為0.000 5和0.411(表1)。

表1 中華金沙鰍和短身金沙鰍采樣點(diǎn)、樣本量、遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)值Tab.1 Sampling sites，sample size，genetic diversity parameters and neutral test of J.sinensis and J.abbreviate populations

注：*表示顯著性檢驗(yàn)P<0.05，**表示顯著性檢驗(yàn)P<0.01。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

基于K2P模型計(jì)算，中華金沙鰍種內(nèi)單倍型之間的遺傳距離為0.001 1～0.039 6，短身金沙鰍種內(nèi)單倍型之間的遺傳距離為0.001 1～0.002 2，這兩種魚(yú)種間的遺傳距離為0.035 7～0.051 5。

中華金沙鰍群體間分子變異方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，來(lái)自群體間遺傳變異組成占-0.75%，來(lái)自群體內(nèi)的變異組成占100.75%，群體總的遺傳分化指數(shù)(FST)為-0.007 53，說(shuō)明中華金沙鰍群體遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)，群體間未出現(xiàn)顯著遺傳分化(表2)。

短身金沙鰍群體間AMOVA分析結(jié)果也顯示群體間未發(fā)生顯著遺傳分化，其變異主要來(lái)源于群體內(nèi)(98.72%)，且FST< 0.05 (FST=0.012 78)(表2)。

分別計(jì)算兩兩群體間的FST，結(jié)果顯示，中華金沙鰍除NN及QJ與部分群體間的FST值大于0.05外，其余群體間FST均小于0.05(表3)。短身金沙鰍顯示，除BN與HJ群體間FST大于0.05外，其余群體間FST均小于0.05(表4)。

表2 中華金沙鰍和短身金沙鰍群體間分子變異分析Tab.2 Analysis of molecular variance (AMOVA)among populations of J.sinensis and J.abbreviata

中華金沙鰍和短身金沙鰍群體間基因流分別見(jiàn)表3和表4。這兩種魚(yú)群體間的Nm值(或絕對(duì)值)均大于4(除JJ與NN、BN與HJ外)表明群體間基因交流比較頻繁。

利用Median Joining方法構(gòu)建中華金沙鰍單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(圖2)，可見(jiàn)單倍型關(guān)系復(fù)雜，無(wú)明顯的中心單倍型。根據(jù)連接單倍型之間的突變步長(zhǎng)，可將單倍型劃分為3個(gè)譜系：Clad I、Clad II、

表3 中華金沙鰍群體間的遺傳分化(對(duì)角線下方)和基因流Nm值(對(duì)角線上方)Tab.3 Pairwise FST (below diagonal)and Nm values (above diagonal)among populations of J.sinensis

表4 短身金沙鰍種群間的遺傳分化(對(duì)角線下方)和基因流Nm值(對(duì)角線上方)Tab.4 Pairwise FST (below diagonal)and Nm values (above diagonal)among populations of J.abbreviata

Clad III譜系間的步長(zhǎng)為10和11，譜系內(nèi)相鄰單倍型之間突變步長(zhǎng)都低于10(除了Clad II內(nèi)的一個(gè)單倍型)。以犁頭鰍(Lepturichthysfimbriata，GenBank登錄號(hào)：DQ105283.1)作為外類(lèi)群，構(gòu)建兩種金沙鰍單倍型NJ樹(shù)和BI樹(shù)(圖3)。兩棵樹(shù)顯示相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，中華金沙鰍和短身金沙鰍的單倍型分為兩個(gè)獨(dú)立分支，形成兩個(gè)單系群。中華金沙鰍的單倍型又分為3個(gè)具有較高支持率的支系。這3個(gè)支系包含的單倍型與中華金沙鰍的Network網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)一致。

2.3 種群歷史

通過(guò)中性檢驗(yàn)Tajima′s D和Fu′s Fs等方法分析種群歷史[15]，中華金沙鰍結(jié)果顯示，總?cè)后w以及3個(gè)譜系群體的Tajima′s D值均不顯著，而Fu′s Fs檢驗(yàn)中均為極顯著負(fù)值(表1)。Bayesian skyline plot (BSP)進(jìn)一步分析表明(圖4)，中華金沙鰍總?cè)后w和3個(gè)譜系群體的擴(kuò)張時(shí)間分別約在距今0.12～0.17、0.1～0.12和0.12～0.17百萬(wàn)年(Ma)。短身金沙鰍群體由于序列變異位點(diǎn)和單倍型數(shù)量少，不作種群歷史分析。

圖2 基于線粒體DNA控制區(qū)序列構(gòu)建的中華金沙鰍單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(短線代表增加一個(gè)突變步驟)Fig.2 Haplotype network of J.sinensis based on mtDNA control region sequences

圖3 基于線粒體DNA控制區(qū)序列的中華金沙鰍和短身金沙鰍單倍型NJ樹(shù)(A)和BI樹(shù)(B)(以犁頭鰍作外類(lèi)群)Fig.3 Haplotype NJ phylogenetic tree (A)and BI phylogenetic tree (B)based on mtDNA control region sequence of J.sinensis and J.abbreviata (L.fimbriata was used as outgroup)

圖4 中華金沙鰍的BSP分析Fig.4 BSP analysis of J.sinensis population

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

本研究顯示，中華金沙鰍具有很高水平的線粒體遺傳多樣性，與Duan等[16]采用微衛(wèi)星標(biāo)記研究的結(jié)果一致，但該研究?jī)H對(duì)雅礱江里莊31尾樣本進(jìn)行了分析，本研究的采樣點(diǎn)和樣本量更為豐富，包含Duan等[16]研究的江段。長(zhǎng)江上游已開(kāi)展的一些鰍科魚(yú)類(lèi)同樣顯示出高水平的遺傳多樣性，如中華沙鰍(Hd=0.986，Pi=0.003 65)[17]、小眼薄鰍(Hd=0.958，Pi=0.004 20)[18]、紅唇薄鰍(Hd=0.907，Pi=0.003 15)[6]、長(zhǎng)薄鰍(Hd=0.916，Pi=0.004 50)[19]等，與長(zhǎng)江鯉科、鲿科等魚(yú)類(lèi)遺傳多樣性高低不同，高遺傳多樣性可能是長(zhǎng)江上游鰍科魚(yú)類(lèi)線粒體DNA共有特征，更快積累變異。但是短身金沙鰍遺傳多樣性水平卻明顯較低，低水平的遺傳多樣性通常是由于近親繁殖或小種群導(dǎo)致[20]。魚(yú)類(lèi)早期資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金沙江干流、長(zhǎng)江上游干流、雅礱江和岷江等均存在中華金沙鰍和短身金沙鰍產(chǎn)卵場(chǎng)，表明它們是同域分布的，但所有產(chǎn)卵場(chǎng)的中華金沙鰍產(chǎn)卵規(guī)模均大于短身金沙鰍[4]，說(shuō)明短身金沙鰍的種群規(guī)模比中華金沙鰍小。種群小容易近交，發(fā)生遺傳漂變，導(dǎo)致遺傳多樣性降低。

3.2 種間及種群分化

長(zhǎng)江大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的種類(lèi)鑒別可以通過(guò)DNA條形碼(mtDNACOI基因)成功解決，但中華金沙鰍和短身金沙鰍例外[21]。這兩種魚(yú)之間Cytb基因的遺傳距離也很低(Cytb：0.008±0.001)，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上出現(xiàn)種間單倍型嵌套，無(wú)法獲得確定的種間區(qū)分[22]。本研究采用線粒體控制區(qū)分析的結(jié)果顯示，兩種金沙鰍的種間單倍型遺傳距離達(dá)到0.035以上，雖然與中華金沙鰍種內(nèi)單倍型之間遺傳距離存在部分重疊，但NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以將它們分開(kāi)(圖3)。這說(shuō)明線粒體控制區(qū)比COI和Cytb基因?qū)鹕出q種類(lèi)鑒別具有更高的區(qū)分度，但遺傳距離上仍然沒(méi)有明顯種間間隔，也說(shuō)明了這兩種魚(yú)物種分化時(shí)間比較晚。

AMOVA分析顯示，中華金沙鰍和短身金沙鰍群體均未發(fā)生地理遺傳分化，可能與其產(chǎn)卵特征有關(guān)。這兩種魚(yú)均產(chǎn)漂流性卵，受精卵隨水漂流較長(zhǎng)的距離而發(fā)育，成體向各棲息地?cái)U(kuò)散，促進(jìn)了不同群體間的基因交流。長(zhǎng)江上游一些產(chǎn)漂流性卵魚(yú)類(lèi)的遺傳結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出類(lèi)似的同質(zhì)性，如長(zhǎng)鰭吻鮈[23]和異鰾鰍鮀[24]等。

盡管未檢測(cè)到地理遺傳分化，但中華金沙鰍單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)顯示形成了三個(gè)具有較高支持率的譜系，表明中華金沙鰍發(fā)生群體內(nèi)遺傳分化。中華金沙鰍這一遺傳結(jié)構(gòu)特征符合Avise等[25]提出的線粒體系統(tǒng)地理學(xué)的第四類(lèi)模式，即具有弱的同域單倍型譜系分化，但沒(méi)有顯著地理分化，是由于缺少長(zhǎng)期亞群體隔離和高水平基因流，或群體擴(kuò)張和單倍型廣泛分布引起。長(zhǎng)江上游一些魚(yú)類(lèi)就具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)，如小眼薄鰍[18]和異鰾鰍鮀[24]等。短身金沙鰍單倍型沒(méi)有出現(xiàn)譜系分化，可能與其單倍型數(shù)少，單倍型間序列差異小有關(guān)。

3.3 種群歷史

BSP分析結(jié)果顯示中華金沙鰍群體在10萬(wàn)～17萬(wàn)年前發(fā)生擴(kuò)張，這一時(shí)期剛好是在第四紀(jì)冰期的廬山亞冰期(20萬(wàn)～23萬(wàn)年前)與大理亞冰期(1萬(wàn)～11萬(wàn)年前)之間的間冰期，間冰期相對(duì)于冰期溫暖[26]，有利于物種生存，也有利于物種從冰期的“避難所”向外擴(kuò)散，發(fā)生種群擴(kuò)張。研究表明，長(zhǎng)江上游的一些魚(yú)類(lèi)像圓筒吻鮈[27]和銅魚(yú)[28]等，也受到冰期影響，其種群在歷史上也發(fā)生過(guò)瓶頸和擴(kuò)張現(xiàn)象。中華金沙鰍在歷史上經(jīng)歷了快速擴(kuò)張，群體內(nèi)可能積累了大量變異，與其較高的遺傳多樣性結(jié)果相吻合。

3.4 保護(hù)建議

本研究發(fā)現(xiàn)兩種金沙鰍均沒(méi)有發(fā)生地理遺傳分化，為單一的進(jìn)化顯著單元，建議就地保護(hù)。目前長(zhǎng)江上游已經(jīng)建成向家壩和溪洛渡等大型水電工程，正在建設(shè)或規(guī)劃建設(shè)更多梯級(jí)水電站，這將使中華金沙鰍和短身金沙鰍等的生境壓縮和碎片化，阻礙群體基因交流。因此，今后還需加強(qiáng)對(duì)長(zhǎng)江上游兩種金沙鰍等魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵場(chǎng)和遺傳多樣性的監(jiān)測(cè)，特別是對(duì)群體小、遺傳多樣性較低的短身金沙鰍的監(jiān)測(cè)和保護(hù)。