李鷙，余淑美，余代鑫，于娟，袁慧君，林少華，徐偉*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建漳州363000)

清熱止咳顆粒由黃芩、陳皮、枳殼、知母、浙貝母、重樓、桔梗等14味中藥組成，具有清熱化痰、宣肺止咳的功效，用于痰熱阻肺所致的咳嗽，痰黏稠或黃，發(fā)熱，急性支氣管炎、慢性支氣管炎(單純型)急性發(fā)作的證候[1]。處方黃芩中的黃芩苷具有抗炎[2]、抗流感病毒[3]等作用，陳皮中的指標(biāo)性成分橙皮苷有抗病毒[4]的作用，枳殼中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化[5-6]等藥效，黃酮類成分被認(rèn)為是清熱止咳顆粒主要藥效成分之一。但目前清熱止咳顆粒的質(zhì)量控制僅以薄層鑒別和黃芩苷單一成分的含量測(cè)定為主[7]，檢測(cè)指標(biāo)單一，對(duì)于14味藥的大復(fù)方質(zhì)量控制不夠全面。因此建立能同時(shí)測(cè)定其中多種指標(biāo)成分的方法，對(duì)于其質(zhì)量控制和確保療效具有重要的意義。

近年來(lái)，超高效液相色譜(UPLC)法廣泛運(yùn)用于中藥及其復(fù)方分析研究中[8-10]，具有高分析效率、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可顯著減少分析時(shí)間，同時(shí)會(huì)減少色譜溶劑的消耗。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，鮮有見(jiàn)UPLC法定量評(píng)價(jià)清熱止咳顆粒的報(bào)道，故本試驗(yàn)建立UPLC法同時(shí)測(cè)定清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷7個(gè)指標(biāo)性成分的含量，為復(fù)方清熱止咳顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1290型超高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品柚皮苷(批號(hào)：110722-201714)、橙皮苷(批號(hào)：110721-201617)、新橙皮苷(批號(hào)：111857-201703)、黃芩苷(批號(hào)：110715-201720)、漢黃芩苷(批號(hào)：112002-201702)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷(批號(hào)：MUST-18030408，成都曼思特生物科技有限公司)；木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(批號(hào)：14080123，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)。清熱止咳顆粒(福建漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為 1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024)。 甲醇、乙腈、水均為色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，15%～20%A；2～5 min，20%～21%A；5～8 min，21%～25%A；8～12 min，25%～30%A；12～15 min，30%～70%A；15～15.1 min，70%～15%A；15.1～18 min，15%～15%A)，柱溫30℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。在此色譜條件下7個(gè)對(duì)照品與其他色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000，色譜峰對(duì)稱性良好。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.648、1.070、0.552、1.078、1.108、0.660 和 0.484 mg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得蕓香柚皮苷 6.480μg·mL-1、柚皮苷26.75 μg·mL-1、橙皮苷 13.80 μg·mL-1、新橙皮苷26.95 μg·mL-1、黃芩苷 55.40 μg·mL-1、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷6.600μg·mL-1和漢黃芩苷4.840μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取清熱止咳顆粒，研細(xì)，精密稱取0.1 g，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱重，70%甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，0.22μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照清熱止咳顆粒處方工藝分別制備缺陳皮、缺枳殼、缺黃芩和同時(shí)缺陳皮和枳殼的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，同法制備相應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.2.4 專屬性考察 分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液及4種陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，與對(duì)照品相同保留時(shí)間處陰性樣品溶液無(wú)干擾，其中蕓香柚皮苷、橙皮苷來(lái)源于陳皮和枳殼，柚皮苷、新橙皮苷來(lái)源于枳殼，黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷來(lái)源于黃芩，UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 線性范圍考察 取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇稀釋配制為不同梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 清熱止咳顆粒中7個(gè)分析物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5μL，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.34%、0.19%、0.27%、0.25%、0.18%、0.29%、0.47%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為1804005的清熱止咳顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 和 24 h 按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.22%、0.08%、0.18%、0.19%、0.22%、0.27%、0.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批清熱止咳顆粒(批號(hào)：1804005)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷峰的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.18%、0.12%、0.17%、0.67%、0.06%、0.06%，RSD 分別為 1.45%、1.84%、1.77%、1.16%、1.68%、1.24%、1.55%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批次清熱止咳顆粒約0.05 g，精密稱定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的7種對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算各個(gè)化合物的回收率和回收率的RSD結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.8 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)為1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024 的清熱止咳顆粒，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定各批次樣品，計(jì)算清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

清熱止咳顆粒由14味中藥組成，前期經(jīng)過(guò)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析，按照成分類別主要為黃酮類、皂苷類、生物堿類和其他類。首先，皂苷類成分主要來(lái)源于方中的知母、桔梗、重樓和甘草，按照分析方法多需要ELSD來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，用目前的UPLC-DAD系統(tǒng)不適合；其次，生物堿類成分主要來(lái)自方中的貝母，如貝母素甲和貝母素乙等屬于生物堿類，因紫外末端吸收，《中國(guó)藥典》2015年版采用ELSD檢測(cè)器；第三，其他類成分，蒼耳子主要成分為有機(jī)酸綠原酸和蒼術(shù)苷，綠原酸出峰時(shí)間過(guò)快且含量較低，無(wú)法準(zhǔn)確定量，而蒼術(shù)苷需要ELSD檢測(cè)；方中苦杏仁主要成分苦杏仁苷屬于末端吸收的氰苷類成分，在207 nm下檢測(cè)基線漂移較大；另外石膏主要成分為硫酸鈣，紫蘇葉主要成分為揮發(fā)油；第四，黃酮類成分，是最主要的一類成分，其中方中鴨跖草含有異葒草素、甘草含有甘草苷，但是兩者含量較低，出峰響應(yīng)不好，而方中的黃芩、陳皮和枳殼，其含有的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷7個(gè)成分含量較高，色譜峰典型，同時(shí)黃芩中的黃芩苷具有抗炎、抗流感病毒等作用，陳皮中的指標(biāo)性成分橙皮苷有抗病毒的作用，枳殼中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化等藥效，這些成分與清熱止咳顆粒主要藥效一致，因此選擇了黃芩苷等7種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

表2 清熱止咳顆粒7個(gè)分析物的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表3 清熱止咳顆粒中7個(gè)分析物的含量(mg·g-1)

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：通過(guò)對(duì)7個(gè)分析物進(jìn)行DAD全波長(zhǎng)掃描，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)為283 nm，黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為277 nm，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為273 nm，綜合7種黃酮類成分在280 nm處均有良好的紫外吸收。因此，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相選擇：分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)及其不同比例梯度洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，7個(gè)黃酮類成分不能基線分離，柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等成分互相干擾，而改用乙腈-水梯度洗脫時(shí)，7種成分分離良好，但是黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的峰形不佳，進(jìn)一步改用乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脫時(shí)，7個(gè)成分的分離效果明顯改善，且峰形較好，基線穩(wěn)定。故最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液做為色譜流動(dòng)相。

色譜柱的選擇：分別考察了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Thermo syncronis aQ 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、CORTECSUPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、Ultimate UHPLC XB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，結(jié)果表發(fā)現(xiàn)Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8μm)在7個(gè)待測(cè)物的色譜峰峰形、分離度及保留時(shí)間上均優(yōu)于其他3根色譜柱。

經(jīng)過(guò)超高效液相色譜條件的優(yōu)化，將同時(shí)測(cè)定的7種成分的分析時(shí)間壓縮到15 min，單針的溶劑消耗少于6 mL，與同類的復(fù)方分析[11-13]相比，具有明顯縮短分析時(shí)間和溶劑消耗。

通過(guò)分析方法學(xué)的驗(yàn)證，本試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、線性范圍和加樣回收率等均符合分析要求。最后通過(guò)對(duì)7批次的清熱止咳顆粒的含量測(cè)定，結(jié)果表明，黃芩苷的含量在6.590～6.977 mg·g-1，其含量是顆粒中最高的成分，來(lái)源于復(fù)方的黃芩藥材；其次，柚皮苷的含量在1.719～1.772 mg·g-1，新橙皮苷的含量在 1.638～1.689 mg·g-1，含量較高的成分，這兩種成分在枳殼和陳皮中均有分布，但是在陳皮中含量顯著低于枳殼[14-15]，因此本次枳殼陰性樣品中并未檢測(cè)出此成分，提示復(fù)方中的柚皮苷和新橙皮苷主要來(lái)源于枳殼藥材；第三，橙皮苷的含量在1.138～1.190 mg·g-1，蕓香柚皮苷的含量在0.431 3～0.452 0 mg·g-1之間，從陰性樣品分析來(lái)看，兩種成分在復(fù)方中的枳殼和陳皮藥材里均有分布，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷在陳皮中的含量顯著高于枳殼[16-17]，但橙皮苷作為陳皮在《中國(guó)藥典》2015年版中規(guī)定含量測(cè)定的指標(biāo)性成分[18]，提示復(fù)方中的橙皮苷主要來(lái)自于的陳皮藥材；第四，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷含量在0.519 0～0.543 3 mg·g-1，漢黃芩苷的含量在0.539 8～0.580 5 mg·g-1，兩者含量相當(dāng)，來(lái)源于復(fù)方的黃芩藥材。

根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物Q-marker理論[19]，現(xiàn)代藥理研究表明黃芩苷能通過(guò)激活TLR7/MYD88信號(hào)通路，抑制 A型流感病毒感染小鼠肺炎癥反應(yīng)[20]；漢黃芩苷等黃芩的黃酮類成分也具有顯著的抗炎活性[21]，枳殼中的柚皮苷類黃酮具有抗氧化應(yīng)激的作用[22-23]，而陳皮中橙皮苷等黃酮可以通過(guò)AMPK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自主免疫，雙向影響甲型流感病毒復(fù)制和傳播[24]，提示清熱止咳顆粒中7種黃酮類成分可能可以通過(guò)抗病毒、抗炎或者抗氧化應(yīng)激發(fā)揮止咳、抗流感的作用，所測(cè)定的7個(gè)黃酮類成分的藥理作用與清熱止咳顆粒的臨床功效相一致，因此黃芩苷等7個(gè)黃酮類成分是清熱止咳顆粒重要的Q-marker成分。

綜上所述，本試驗(yàn)所建立的UPLC同時(shí)測(cè)定清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷含量的方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確且可行，可以為清熱止咳顆粒質(zhì)控的提升提供參考。