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      燈盞花素對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響

      2020-06-08 03:35:46趙中華張?zhí)姨?/span>
      實用藥物與臨床 2020年1期
      關(guān)鍵詞:復(fù)氧花素燈盞

      趙中華,張?zhí)姨遥?慧

      0 引言

      大腦缺血時誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),釋放脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、谷氨酸、興奮性氨基酸及炎性因子,加重腦組織損傷[1-2]。神經(jīng)細胞損傷后不可逆,因此,盡快恢復(fù)腦組織血流、保證腦組織氧供對神經(jīng)元突觸的重塑及存活有著重要意義。燈盞花素(Scutellarin)是臨床常用的腦保護劑,具有減輕組織水腫、改善微循環(huán)、抗氧化、擴張血管的作用[3-4]。

      缺血性腦卒中是一個復(fù)雜的病理生理過程,涉及神經(jīng)細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)。Bcl-2蛋白屬膜整合蛋白,能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì),從而抑制細胞凋亡。Bax是重要的促細胞凋亡基因之一,其過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應(yīng)而使細胞趨于死亡。本實驗采用缺氧/復(fù)氧模式模擬在體腦缺血再灌注損傷,以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對象,研究燈盞花素對神經(jīng)元的保護作用及機制,為其臨床應(yīng)用提供科學的實驗資料。

      1 材料與方法

      1.1 材料 燈盞花素(美國Sigma公司,純度>99%),DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司),CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),LDH、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物試劑公司),2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi hydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)熒光探針(美國BD公司),F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司),Bcl-2及Bax抗體(上海碧云天公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 細胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)SD大鼠,置于培養(yǎng)皿中,無菌條件下取大腦皮層,快速剪碎后置于含0.125%胰蛋白酶的PBS液中,37 ℃消化15 min,制備細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清液后將細胞接種于塑料培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3~5 d換液1次。

      1.2.2 缺氧復(fù)氧模型的建立及細胞分組 共分4組,每組5個復(fù)孔。①對照組:常規(guī)培養(yǎng)。②模型組(神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧模型):細胞置37 ℃培養(yǎng)罐中,緩慢持續(xù)通入含有5% CO2+95% N2的混合氣體30 min,至罐內(nèi)氧氣含量低于1%,造成神經(jīng)元缺氧,密封培養(yǎng)罐4 h后,將原來的培養(yǎng)液吸除,重新更換培養(yǎng)液,立即將細胞移至37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h,使細胞復(fù)氧。③燈盞花素低、高濃度組:進行缺氧/復(fù)氧操作前0.5 h,在培養(yǎng)基中加入溶于DMSO的燈盞花素(1、10 μmol/L),其余步驟同模型組。

      1.2.3 CCK-8法測定神經(jīng)元細胞增殖 神經(jīng)元培養(yǎng)于96孔板內(nèi),每孔200 μl,細胞密度為1×105/ml,棄去原有培養(yǎng)液,將已配置含10% CCK-8的培養(yǎng)基以換液的形式加入,接種后的96孔板37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,觀察細胞已貼壁。用480 nm吸光度進行檢測。

      1.2.4 各組細胞上清液LDH及細胞內(nèi)SOD、MDA檢測 收集神經(jīng)元細胞上清液,嚴格按照LDH試劑盒說明書檢測各組細胞上清液LDH活性;另取各組細胞,裂解后按照SOD、MDA試劑盒的方法進行各樣本吸光度值檢測。

      1.2.5 流式細胞技術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)活性氧表達 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)于6孔板中,每孔500 μl,細胞密度為1×105個/ml,磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)沖洗3遍,離心(1 000 r/min)后收集細胞,黑暗中在室溫下加入5 μl H2DCFDA染料,15 min后流式細胞儀檢測并分析細胞內(nèi)活性氧表達量變化。

      1.2.6 FITC Annexin V細胞凋亡檢測 收集細胞后PBS制備細胞懸液,1 000 r/min離心并收集細胞,離心管內(nèi)加入300 μl緩沖液,混勻后加入5 μl Annexin-V和10 μl PI,避光反應(yīng)30 min后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

      1.2.7 Western blot檢測Bcl-2及Bax的蛋白表達水平 收集細胞并提取總蛋白,10 000 r/min離心10 min后取上清,行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4 ℃封閉2 h,加一抗過夜,室溫下孵育二抗1 h,ECL化學發(fā)光法自顯影并采集圖像。

      2 結(jié)果

      2.1 燈盞花素濃度對神經(jīng)元細胞存活率的影響 模型組神經(jīng)元細胞存活率為36.68%±4.79%,對照組為100.42%±4.55%,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。用1、10 μmol/L燈盞花素處理后,細胞存活率逐漸提高,分別為59.87%±4.53%和69.93%±5.27%,與對照組及模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

      表1 燈盞花素對神經(jīng)元細胞存活率的影響

      注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

      2.2 燈盞花素對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細胞LDH外漏及SOD、MDA水平的影響 與對照組相比,模型組細胞外培養(yǎng)基中LDH的釋放顯著增加(P<0.05)。與模型組相比,燈盞花素能夠顯著降低缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細胞外上清液中LDH水平(P<0.05),說明燈盞花素能緩解細胞損傷。與對照組比較,模型組神經(jīng)元細胞內(nèi)SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);與模型組比較,燈盞花素組能顯著升高SOD活力,降低MDA水平(P<0.05),且與濃度相關(guān)。其中,燈盞花素高濃度組中LDH及SOD水平與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明燈盞花素可以部分恢復(fù)LDH及SOD水平。見表2。

      表2 燈盞花素對缺氧/復(fù)氧皮質(zhì)神經(jīng)元損傷LDH、SOD和MDA的影響

      注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

      2.3 燈盞花素對神經(jīng)元細胞內(nèi)ROS的影響 H2DCFDA熒光探針標記法是一種檢測細胞內(nèi)ROS生成量變化的檢查方法,細胞氧化損傷程度越重,主峰越向右側(cè)偏移。流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示,對照組細胞內(nèi)ROS表達均較低,ROS主峰位于基線左側(cè),模型組DCF熒光信號明顯增強,ROS主峰位于基線右側(cè),不同濃度燈盞花素干預(yù)后,熒光信號強度逐漸減弱,ROS主峰向基線左側(cè)移位。見圖1。

      圖1 流式細胞技術(shù)檢測神經(jīng)元細胞內(nèi)ROS改變

      2.4 燈盞花素對神經(jīng)元細胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下,對照組未見明顯凋亡細胞,細胞核均為暗藍色低熒光;模型組細胞核著色不均勻,凋亡細胞呈亮藍色高熒光;1、10 μmol/L燈盞花素處理后凋亡細胞數(shù)量逐漸減少。見圖2、表3。

      圖2 Hoechst染色觀察神經(jīng)元細胞凋亡

      2.4 Bcl-2及Bax蛋白表達水平檢測 Bcl-2蛋白在模型組中的表達明顯降低,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);低、高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達逐漸升高,與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Bax蛋白在模型組中的表達明顯升高,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);燈盞花素干預(yù)可降低Bax蛋白的表達,低、高劑量燈盞花素組Bax蛋白的相對表達量與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中,高劑量燈盞花素組Bcl-2蛋白的相對表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明高劑量燈盞花素促進了神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2表達趨于正?;?。見圖3、表4。

      表3 燈盞花素對神經(jīng)元細胞凋亡的影響

      注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

      圖3 燈盞花素對神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2及Bax表達的影響

      表4 各組Bcl-2及Bax蛋白相對表達比較

      組別Bcl-2Bax對照組0.80±0.220.21±0.06模型組0.19±0.12*0.83±0.11*燈盞花素低濃度組0.29±0.16*#0.45±0.10*#燈盞花素高濃度組0.75±0.18#0.39±0.12*#

      注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

      3 討論

      臨床上,燈盞花素已經(jīng)用于輔助治療腦卒中[5-6]。研究表明,燈盞花素通過擴張腦血管改善微循環(huán)、恢復(fù)缺血病變區(qū)血流量等方式復(fù)原和改善神經(jīng)功能;此外,燈盞花素還可減輕腦組織血管損傷和炎癥反應(yīng),從而減少缺血缺氧對神經(jīng)功能的損傷,對腦缺血疾病有較好的療效[5,7]?;跓舯K花素較強的抗氧化損傷作用,可以有效清除自由基,對改善患者生活能力和認知功能有明確效果[6]。

      關(guān)于燈盞花素對原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷保護作用的研究不多,徐露等[8]觀察燈盞花素聯(lián)合冰片對缺氧/復(fù)氧下原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞影響,結(jié)果顯示,兩者聯(lián)合應(yīng)用可促進ZO-1和Claudin-5蛋白的表達,維持血腦屏障(BBB)緊密連接的完整性。

      多種腦血管疾病的損傷機制與神經(jīng)細胞的缺氧/復(fù)氧損傷密切相關(guān)[9]。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧后,谷氨酸遞質(zhì)及嘌呤類代謝產(chǎn)物增加,復(fù)氧后在黃嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS)堆積,ROS水平高低與腦損傷程度直接相關(guān)。當ROS水平較高時,神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強,細胞損傷加重[10-11]。本研究結(jié)果顯示,缺氧/復(fù)氧破壞了神經(jīng)元正常生理功能,細胞存活率顯著下降。

      LDH存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi),其含量高低可反映細胞膜的完整性。SOD是細胞內(nèi)具有抗氧化作用的酶,SOD水平高低反映了機體間接清除氧自由基的能力,兩者活力和含量可反映細胞抗氧化的能力。MDA是膜質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生能增加細胞膜損傷,因此,可通過MDA了解膜質(zhì)過氧化的程度,以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。本實驗結(jié)果顯示,燈盞花素預(yù)處理能顯著降低缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細胞外上清液中LDH漏出率,增加缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細胞內(nèi)SOD的表達,降低細胞內(nèi)MDA含量。

      H2DCFDA熒光探針是一種檢測細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的染色方法。本研究采用流式細胞技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對神經(jīng)元的氧化損傷程度,觀察結(jié)果顯示,模型組神經(jīng)元氧化損傷明顯,燈盞花素可以不同程度地抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷。

      Hoechst 33258染色劑能嵌入凋亡細胞的細胞核DNA,使細胞核濃染,呈致密顆粒和(或)塊狀藍色高熒光。本實驗中,模型組中亮藍色熒光明顯增多,證實缺氧/復(fù)氧可以誘發(fā)神經(jīng)元細胞凋亡,燈盞花素低濃度組及燈盞花素高濃度組中凋亡細胞比例逐漸降低。

      腦缺血/再灌注引起的細胞損傷可以通過細胞凋亡的方式導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[12]。Bcl-2在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡反應(yīng)中起重要作用,具有潛在的抗凋亡作用[13]。Bax表達水平的高低直接反映細胞凋亡程度,Western blot結(jié)果顯示,模型組細胞中Bcl-2蛋白表達明顯降低,Bax蛋白表達明顯增加,提示缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡,燈盞花素通過改變Bcl-2、Bax蛋白的表達發(fā)揮抗細胞凋亡作用。

      綜上所述,燈盞花素能夠有效抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,為預(yù)防和治療缺血性腦卒中及退行性神經(jīng)疾病提供了理論支持。

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