聚合酶鏈反應技術建立巴爾通體的檢測鑒定方法 并用于診斷臨床疑似貓抓病合并雙側(cè)支氣管肺炎患者分析

賈鵬霞 程江

【摘要】目的 探討用聚合酶鏈反應（PCR）技術建立巴爾通體的檢測鑒定方法并用于診斷臨床疑似貓抓病合并雙側(cè)支氣管肺炎患者的價值。方法 依據(jù)16S-23SrRNA ITS基因序列長于其他細菌，且此段基因序列當中的tRNAIle-tRNAAla基因間隔區(qū)的變異性高，而在巴爾通體屬當中，tRNAIle、tRNAAla基因序列完全保守;此外，利用兩對引物對一例可疑貓抓病患者的全血基因組DNA進行直接擴增。結(jié)果 通過開展序列分析得知，設計引物TIle.455p～TAla.885n擴增產(chǎn)物核昔酸序列一致于巴爾通體一分離株對應位置，同源性達到100%。結(jié)論 在血液中采用PCR技術實施直接擴增特異基因片段，能夠?qū)Π蜖柾w感染進行快速檢測。

【關鍵詞】聚合酶鏈反應技術;巴爾通體;貓抓病;雙側(cè)支氣管肺炎

【中圖分類號】R446 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.8..01

巴爾通體實為一群氧化酶呈陰性，革蘭染色呈陰性，其不僅能誘發(fā)戰(zhàn)壕熱病，還能引起巴爾通體病（Carrion）、貓抓病（CSD）等[1-2]。本文構(gòu)建基于聚合酶鏈反應（PCR）的巴爾通體感染檢測方法，對1例發(fā)熱肺炎患者的全血DNA進行檢測，并從中將巴爾通體特異基因片段擴增出來，現(xiàn)對此分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者，男，48歲，在此次發(fā)病前，有典型的貓抓傷史;咳嗽、發(fā)熱、胸痛為其典型臨床表現(xiàn);而經(jīng)查體得知，貓抓傷側(cè)的腋窩以及腹股溝淋巴結(jié)均存在腫大情況，且肝脾也存在腫大情況。

1.2 陽性對照菌株

本文所選用巴爾通體菌株TR222SM、RT221SM、RT225SM分離，都為鼠類動物血液，且均經(jīng)中國疾預防控制中心用PCR及測序技術明確為巴爾通體。

1.3 提取全血DNA

取600 ?L血，加入到濃度為1%的SDS中，蛋白酶K（20 mg/mL）濃度0.2 mg/mL，RNase濃度為57 ?g/mL，充分混勻，水?。?5℃），分別用氯仿、飽和酚進行數(shù)次抽提，取上清液，離心處理（12000 r/min），將管中液體舍去，利用1 mL濃度為70%的乙醇對DNA進行清洗，沉淀二次，再離心10分鐘，于-20℃保存。

1.4 引物

查找巴爾通體16S～23SrRNA基因間隔區(qū)（ITS）序列，借助DNAsis序列分析軟件，開展多序列比較，設計引物TIle.455p～TAla.885n擴增16S～23SrRNA ITSs當中的tRNAIle與tRNAAla基因間隔區(qū)序列，擴增片段最小為300 bp，最大為500bp。

1.5 PCR反應及產(chǎn)物檢測

在模板DNA中加入1?l的反應體系，以及1.5 ?L的Taq DNA聚合酶、1 ?L的引物、2 ?L的dNTP，另將適量離子水加入，使總量達25 ?L，采用PCR基因擴增儀（Robocycler Gradient 40型）。取擴增產(chǎn)物5 ?L，將電泳載樣液1 ?L加入，另將瓊脂糖電泳（1%）加入，時間為40分鐘，紫外線燈照射，且進行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 PCR結(jié)果

將全血基因組DNA作為模板，三對引物都擴增出陽性產(chǎn)物，而對于陽性對照，都擴增出特異基因片段，另外，空白對照都沒有擴增帶。針對引物BhCS.781～bhCS.1137n，其擴增出gltA基因380 bp片段;而對于引物Bh.311p～Bh.452n而言，其擴增出16S～23SrRNA ITSN'末端163bp片段;在本次研究當中，共擴增出片段451bp，與巴爾通體tRNAIle-tRNAAla基因間隔區(qū)預測帶的大小相符。

2.2 核苷酸測序結(jié)果

引物Tile.455p～TAla.885n PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果為，序列的長度為451bp，其中，針對1～75bp，其實為3'-端tRNAIle基因序列;而對于76～410bp，其則為tRNAIle-tRNAAla基因序列。通過開展序列分析得知，設計引物TIle.455p～TAla.885n擴增產(chǎn)物核昔酸序列一致于巴爾通體一分離株對應位置，同源性達到100%。

3 討 論

巴爾通體屬布魯氏菌、根瘤菌目、α亞群及變形菌綱等高同源性?，F(xiàn)階段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19種巴爾通體，其中，多達7種能夠引發(fā)人類疾病，如漢賽、五日熱、桿菌樣等[3]。伴隨當今分子生物學及細菌分子遺傳學檢測方法的持續(xù)更新與完善，許多致病巴爾通體所造成的不良預后被發(fā)現(xiàn)且明確，人們對此種病原微生物所開展的研究日漸增多且深入。近年，伴隨序列測定技術及PCR技術的不斷發(fā)展，以及其在病原體檢測中的不斷應用，其為致病微生物鑒定，提供了一種實用且高效的手段。針對引物引物BhCS.781-bhCS.1137n而言，其能夠擴增各種巴爾通體片段，而且還能實現(xiàn)與巴爾通體之間有較高同源性的根癌土壤桿菌等無擴增產(chǎn)物的擴增，因而是一種水平特異性。從本文研究結(jié)果可知，在血液中采用PCR技術實施直接擴增特異基因片段，可以對巴爾通體感染進行準確且快速的檢測。

參考文獻

[1] 葉 曦，姚美琳，李國偉.巴爾通體實驗檢測技術簡介[J].中國人獸共患病學報，2017，23（11）：1160-1162.

[2] 王 琪.貓抓病2例臨床病理分析[J].中國基層醫(yī)藥，2017，16（9）：1577-1578.