李衡，龐楓騫，姜彬，劉志文

(1.北京理工大學(xué) 信息與電子學(xué)院，北京 100081; 2.北京理工大學(xué) 光電學(xué)院，北京 100081;3.國(guó)家留學(xué)基金管理委員會(huì) 信息資源部，北京 100081)

細(xì)胞是生物體最小的組成單元，其狀態(tài)能夠直接反映生物體的許多生理信息，因此細(xì)胞常被作為重要的研究對(duì)象，用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究工作. 另一方面，細(xì)胞的形態(tài)受到細(xì)胞自身生理活動(dòng)和所處環(huán)境的共同影響，能夠提供多種細(xì)胞生理狀態(tài)信息，是細(xì)胞篩選、識(shí)別和分類的重要依據(jù)[1-2].

近年來(lái)，隨著顯微成像技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞圖像序列被越來(lái)越多的用于細(xì)胞生理研究中，細(xì)胞形態(tài)的變化也逐漸成為研究者觀察的重要目標(biāo). 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形變能夠更快速、準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的狀態(tài)和活動(dòng)，對(duì)檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)、預(yù)測(cè)細(xì)胞周期、研究細(xì)胞生理具有重要意義[3-4]. 卡耐基梅隆大學(xué)Murphy教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)[5]在利用形態(tài)特征描述細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分布狀態(tài)的研究方面不斷有新的進(jìn)展，報(bào)道了亞細(xì)胞局部特征提取，使用三維圖像分析蛋白質(zhì)分布[6]，將蛋白質(zhì)分布分析應(yīng)用于癌癥早期檢測(cè)[7]等多項(xiàng)工作. 南開(kāi)大學(xué)趙新教授帶領(lǐng)研究組對(duì)使用細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)細(xì)胞活性的方法進(jìn)行了研究，提出一種基于形態(tài)參數(shù)度量細(xì)胞活性的方法[8]. 因此準(zhǔn)確高效地度量和分類細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變能夠?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)研究提供強(qiáng)力幫助.

本文以植皮后小鼠淋巴細(xì)胞的形變作為研究對(duì)象，根據(jù)淋巴細(xì)胞形變的特性，設(shè)計(jì)出一種能夠有效處理細(xì)胞形變過(guò)程中空時(shí)信息的特征提取方法，并將其應(yīng)用于兩個(gè)淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù)集上. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所提出的方法能夠準(zhǔn)確度量和分析淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形變，相比于其他形變度量算法具有更高的準(zhǔn)確性和更好的魯棒性.

1 淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù)

淋巴細(xì)胞的形變數(shù)據(jù)由合作單位，北京佑安醫(yī)院負(fù)責(zé)采集. 淋巴細(xì)胞采集自經(jīng)過(guò)植皮手術(shù)的小鼠(周齡6～8，體重20～22 g)外周血，使用相差顯微鏡(奧林帕斯BX51，放大倍率1 000×)進(jìn)行觀察，每次僅觀察一個(gè)淋巴細(xì)胞. 將目標(biāo)淋巴細(xì)胞置于顯微鏡視野中心后，并使用超顯微真彩圖像分析系統(tǒng)對(duì)影像進(jìn)行進(jìn)一步放大和拍攝. 以25幀/s的速度拍攝淋巴細(xì)胞20～30 s，保存為分辨率288×352的AVI格式視頻數(shù)據(jù). 隨后，對(duì)視頻數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，剔除拍攝不清晰，或淋巴細(xì)胞與其他細(xì)胞有重疊的數(shù)據(jù). 圖1展示了視頻數(shù)據(jù)的截圖，其中每行對(duì)應(yīng)一個(gè)視頻的圖像序列，每列圖片采樣時(shí)間間隔為5 s，完整的視頻數(shù)據(jù)示例可從http://isip.bit.edu.cn/kyxz/xzlw/77051.htm下載.

數(shù)據(jù)采集中，分別使用兩種小鼠實(shí)驗(yàn)方式，獲得兩個(gè)淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù)集.

數(shù)據(jù)集Ⅰ：包含兩個(gè)小鼠植皮實(shí)驗(yàn)組，第一組使用20個(gè)健康雄性Balb/C小鼠進(jìn)行自體皮膚移植；第二組使用20個(gè)健康雄性Balb/C小鼠作為受體，20個(gè)健康雄性C57BL/6小鼠作為皮膚供體，進(jìn)行異體皮膚移植. 14 d后，斷尾采集小鼠外周血，觀察和拍攝淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù). 將組別作為數(shù)據(jù)標(biāo)簽，每組各包含40個(gè)視頻數(shù)據(jù).

數(shù)據(jù)集Ⅱ：僅有一個(gè)小鼠植皮實(shí)驗(yàn)組，使用25個(gè)健康雄性Balb/C小鼠作為受體，25個(gè)健康雄性C57BL/6小鼠作為皮膚供體，進(jìn)行異體皮膚移植. 7 d后，斷尾采集小鼠外周血，觀察和拍攝淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù). 由3名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的觀察者對(duì)淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變進(jìn)行判別，將視頻數(shù)據(jù)人工分為4組(正常組，輕度活躍組，中度活躍組和高度活躍組)，最終通過(guò)投票方式確定數(shù)據(jù)標(biāo)簽，每組各包含25個(gè)視頻數(shù)據(jù).

2 形變局部時(shí)序特征提取

通過(guò)對(duì)細(xì)胞視頻數(shù)據(jù)的詳細(xì)觀察，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)變化不僅在時(shí)間維度上有連續(xù)性，還在空間的各個(gè)局部區(qū)域間表現(xiàn)出不一致性. 為了更直觀地展示細(xì)胞形變的特性，圖2中給出了數(shù)據(jù)集I中兩類細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變的對(duì)比圖. 圖中已提取出細(xì)胞圖像序列的輪廓，并使用細(xì)胞輪廓序列繪制出細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形變. 可以看出，對(duì)于正常形變的細(xì)胞，其輪廓相對(duì)穩(wěn)定，整體變化不明顯，只在少數(shù)區(qū)域能看到輪廓的演化. 與之相對(duì)，異常形變細(xì)胞的輪廓變化顯著，在形變劇烈的區(qū)域還可以看出較明顯的連續(xù)性；同時(shí)整個(gè)細(xì)胞各部分形變程度并不統(tǒng)一，圖中左側(cè)區(qū)

域的形變程度遠(yuǎn)高于右側(cè). 根據(jù)觀察結(jié)果，設(shè)計(jì)出一種能夠有效處理淋巴細(xì)胞形變特性的特征提取算法.

2.1 基于徑向距離的細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變描述

細(xì)胞的輪廓變化能夠很好地反映其形變過(guò)程，因此首先利用細(xì)胞輪廓序列描述細(xì)胞的整個(gè)形變過(guò)程. 考慮到這里所觀察的淋巴細(xì)胞主要呈圓形和橢圓形，具體使用圖像特征中的徑向距離方法，表示細(xì)胞輪廓序列. 將在角度k處，時(shí)間點(diǎn)t的輪廓點(diǎn)的徑向距離定義為

k∈[0,360)，t=1,2,…,T.

(1)

式中：細(xì)胞圖像序列第一幀的細(xì)胞質(zhì)心(xc,yc)被作為提取徑向距離的參考點(diǎn);(xk,t,yk,t)表示角度k處，時(shí)間點(diǎn)T的輪廓點(diǎn)位置;T為細(xì)胞圖像序列的長(zhǎng)度. 圖3(a)3(b)中展示了使用徑向距離表示的細(xì)胞形變輪廓序列.

隨后，從時(shí)間維度分析細(xì)胞輪廓點(diǎn)的形變信息，將式(1)中的徑向距離函數(shù)表示成細(xì)胞輪廓上角度k處隨時(shí)間t的變化函數(shù)Ck(t). 如圖3(c)3(e)所示，以角度為120°的輪廓點(diǎn)為例，將細(xì)胞輪廓的徑向距離函數(shù)表示為其隨時(shí)間t的變化，記為C120(t)，其曲線如圖3(c)3(e)中的灰色曲線.

從圖中可以看出，細(xì)胞輪廓點(diǎn)的徑向距離函數(shù)在其隨時(shí)間t變化的過(guò)程中趨勢(shì)并不穩(wěn)定，灰色曲線上有許多抖動(dòng). 對(duì)圖中的灰色曲線進(jìn)行比較，在相對(duì)較短的時(shí)間段內(nèi)(大約20幀以內(nèi))，受到曲線抖動(dòng)的影響，人眼無(wú)法區(qū)分圖中灰色曲線的差別. 幸運(yùn)的是，當(dāng)從一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間段觀察灰色曲線，圖3(e)中的曲線有比較明顯的變化趨勢(shì).

根據(jù)這一觀察結(jié)論，提出利用曲線平滑的方法增強(qiáng)該輪廓點(diǎn)變化的趨勢(shì)信息. 實(shí)際中，使用7階多項(xiàng)式平滑的方式，得到平滑后的曲線fk(t)，如圖3(c)3(e)中黑色曲線所示. 通過(guò)黑色曲線，能夠更清楚地觀察和區(qū)分兩個(gè)細(xì)胞輪廓點(diǎn)的不同變化過(guò)程.

2.2 局部時(shí)序特征

根據(jù)細(xì)胞輪廓點(diǎn)隨時(shí)間的變化過(guò)程，可以看出細(xì)胞的局部變化特性能夠反應(yīng)出細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變的重要信息. 因此，通過(guò)提取細(xì)胞變化的局部時(shí)序特征，能夠更加有效地度量細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形變.

以平滑后的細(xì)胞輪廓點(diǎn)隨時(shí)間的形變曲線為基礎(chǔ)，提取細(xì)胞輪廓點(diǎn)變化的時(shí)序特征. 根據(jù)觀察，細(xì)胞輪廓點(diǎn)的變化趨勢(shì)是整個(gè)變化過(guò)程中最顯著的特征. 因此，對(duì)平滑曲線fk(t)求導(dǎo)，得到其導(dǎo)數(shù)f′k(t)，如圖3(d)3(f)中灰色曲線所示. 鑒于細(xì)胞輪廓點(diǎn)的變化僅有遠(yuǎn)離中心和朝向中心點(diǎn)兩個(gè)方向，使用細(xì)胞輪廓點(diǎn)隨時(shí)間運(yùn)動(dòng)的方向?qū)π巫冓厔?shì)進(jìn)行區(qū)分. 對(duì)應(yīng)到曲線f′k(t)，作為平滑曲線fk(t)的導(dǎo)數(shù)，其正值對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)離中心的運(yùn)動(dòng)，負(fù)值對(duì)應(yīng)朝向中心的運(yùn)動(dòng). 所以，可以使用f′k(t)取值的正負(fù)號(hào)區(qū)分輪廓點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì). 在同一變化趨勢(shì)下，計(jì)算輪廓點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的累積量Gk描述對(duì)應(yīng)形變的時(shí)序特征，如圖3(d)3(f)中的青色區(qū)域. 在實(shí)際計(jì)算時(shí)，以f′k(t)取值的符號(hào)變化點(diǎn)作為邊界，對(duì)取絕對(duì)值后的f′k(t)進(jìn)行積分，計(jì)算Gk，其定義為

(2)

式中：τj表示f′k(t)取值符號(hào)變化的點(diǎn)；T為細(xì)胞圖像序列的長(zhǎng)度；j和J分別表示符合變化點(diǎn)的序數(shù)和總數(shù).

最后，計(jì)算Gk的最大值作為角度k處細(xì)胞輪廓點(diǎn)的局部時(shí)序變化量，并對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞各輪廓點(diǎn)的變化量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制20個(gè)平均間隔的直方圖. 將某個(gè)細(xì)胞圖像序列在該直方圖各區(qū)間的分布作為其局部時(shí)序形變特征向量.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

使用淋巴細(xì)胞形變數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證所提算法的效果，并與若干個(gè)使用圖像特征的形變度量算法進(jìn)行比較，分析所提算法的效果. 實(shí)驗(yàn)中，使用高斯核函數(shù)的支持向量機(jī)(SVM)作為分類器訓(xùn)練分類模型. 整個(gè)分類過(guò)程使用5折交叉驗(yàn)證，獨(dú)立隨機(jī)重復(fù)100次，最終使用精確率(真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性))，召回率(真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性))和F值((2×精確率×召回率)/(精確率+召回率))作為評(píng)價(jià)分類效果的標(biāo)準(zhǔn).

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的淋巴細(xì)胞預(yù)先使用主動(dòng)輪廓模型進(jìn)行了分割， 進(jìn)行了尺度歸一化和序列對(duì)齊的操作. 這里分別使用徑向距離、傅里葉描述子[9]、通用傅里葉描述子(generic fourier descriptor，GFD)[10]、Zernike矩[11]和閾值鄰域統(tǒng)計(jì)(threshold adjacency statistics，TAS)[12]，5種圖像特征為基礎(chǔ)的算法分析細(xì)胞形變，并進(jìn)行比較. 此外，前期工作提出的匹配游程統(tǒng)計(jì)方法的結(jié)果也一起給出. 具體計(jì)算時(shí)，徑向距離和傅里葉描述子都取180維，通用傅里葉描述子的角度和半徑分辨率為60和180， Zerniek矩共30階. 以1 s(25幀)為間隔對(duì)細(xì)胞視頻采樣后，對(duì)樣本圖像序列依次計(jì)算特征值，隨后使用歐氏距離量化相鄰樣本圖像間的差異. 最后，統(tǒng)計(jì)歐氏距離的值，并對(duì)全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算有20個(gè)平均間隔的直方圖，將其作為描述細(xì)胞形變的特征矢量，使用SVM分類.

3.1 數(shù)據(jù)集Ⅰ

首先在數(shù)據(jù)集Ⅰ上對(duì)現(xiàn)有的方法進(jìn)行驗(yàn)證. 數(shù)據(jù)集Ⅰ包含兩個(gè)分類，各有40個(gè)細(xì)胞視頻數(shù)據(jù)，5折交叉驗(yàn)證中，每類隨機(jī)選取32個(gè)數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集，8個(gè)為測(cè)試集. 分類結(jié)果在訓(xùn)練集和測(cè)試集上的平均精確率(TrPr，TePr)，召回率(TrRe，TeRe)和F值(TrF，TeF)均已在表1中給出.

表1 數(shù)據(jù)集Ⅰ細(xì)胞形變分類結(jié)果Tab.1 Classification results of cell deformation in Dataset Ⅰ %

由于所研究的淋巴細(xì)胞一般為圓形或橢圓形，使用徑向距離能夠很好地提取細(xì)胞形變特征，因此其能夠表現(xiàn)出良好的效果. 傅里葉描述子是通過(guò)對(duì)目標(biāo)的輪廓曲線做一維傅里葉變化得到的，因此相比于其他特征提取方法，其對(duì)噪聲更加敏感，因此傅里葉描述子表現(xiàn)并不突出. 通用傅里葉描述子和Zernike矩都從目標(biāo)圖像中提取高維特征矢量描述形狀，能夠分辨不同形狀間的細(xì)小差異，是處理復(fù)雜形狀的有力工具，在細(xì)胞形態(tài)研究中有廣泛應(yīng)用[5, 13-14]. 在研究細(xì)胞形變時(shí)，使用通用傅里葉描述子和Zernike矩得到的特征矢量可以有效描述細(xì)胞形態(tài)的細(xì)節(jié)，以此為基礎(chǔ)計(jì)算出的特征空間距離能夠提取細(xì)胞形態(tài)間的細(xì)小差異，準(zhǔn)確描述形變特性. 閾值鄰域統(tǒng)計(jì)是用于描述細(xì)胞紋理的特征，其主要用于研究細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的灰度分布變化. 雖然在細(xì)胞形變的過(guò)程中，細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的紋理也會(huì)隨之變化，但是這種變化不是細(xì)胞形變的主要信息. 故而，基于紋理特征分析細(xì)胞形變無(wú)法發(fā)揮良好效果.

使用所提出的算法，細(xì)胞形變過(guò)程中的時(shí)序信息被最大程度地保存下來(lái)，有效提高了對(duì)形變的分類結(jié)果. 不僅如此，局部時(shí)序特征充分考慮的細(xì)胞形變中各個(gè)局部區(qū)域變化不一致的情況，分別度量細(xì)胞各輪廓點(diǎn)的時(shí)序形變，最后對(duì)細(xì)胞整體形變做出綜合評(píng)價(jià). 所以，局部時(shí)序特征非常適合用于淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變的研究.

3.2 數(shù)據(jù)集Ⅱ

數(shù)據(jù)集Ⅱ包含4個(gè)分類，各有25個(gè)細(xì)胞視頻數(shù)據(jù)，使用5折交叉驗(yàn)證時(shí)，從各類別中隨機(jī)選取20個(gè)數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集，5個(gè)為測(cè)試集. 表2中給出了各算法在數(shù)據(jù)集Ⅱ上的分類結(jié)果.

表2 數(shù)據(jù)集Ⅱ細(xì)胞形變分類結(jié)果Tab.1 Classification results of cell deformation in Dataset Ⅱ %

相比于數(shù)據(jù)集Ⅰ，各算法在數(shù)據(jù)集Ⅱ上的效果均明顯降低. 這首先是由于數(shù)據(jù)集Ⅱ上的多分類問(wèn)題明顯比數(shù)據(jù)集Ⅰ上的二分類問(wèn)題復(fù)雜，會(huì)影響算法的表現(xiàn). 其次，數(shù)據(jù)集Ⅰ中的兩個(gè)類別分別是從自體皮膚移植和異體皮膚移植小鼠的淋巴細(xì)胞采集而來(lái)，兩個(gè)類別間細(xì)胞形變差異顯著，比較易于分辨；而數(shù)據(jù)集Ⅱ中各類別是根據(jù)人工觀察標(biāo)記而來(lái)，細(xì)胞本身所處生理?xiàng)l件上沒(méi)有差異，形變間區(qū)分度相對(duì)較低. 而且受到人工標(biāo)記影響，數(shù)據(jù)集Ⅱ的分類標(biāo)簽中包含人為偏差，更提高了分類的難度.

在分類效果上，對(duì)比算法的效果下降比所提出的算法更加顯著，這是由于對(duì)數(shù)據(jù)集Ⅱ中的細(xì)胞形變進(jìn)行分類更加需要充分提取形變信息. 直接從相鄰幀的形態(tài)差異提取形變，對(duì)比算法對(duì)圖像序列進(jìn)行采樣，再?gòu)臉颖編g提取形變信息的框架本身就丟失了許多未被采樣到的形變信息. 然而，由于顯微視頻數(shù)據(jù)幀間隔時(shí)間短，對(duì)全部幀提取形態(tài)，信噪比低，難以從噪聲中分辨有用信息.

為了更有效地展示所提算法的效果，將數(shù)據(jù)集Ⅱ上每個(gè)視頻數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的局部時(shí)序特征直方圖在圖4中進(jìn)行展示. 圖中可以看出，細(xì)胞形變正常組的特征值整體較小，且分布比較集中. 而隨著細(xì)胞形變活躍度的提高，特征值不斷變大，且分布越來(lái)越分散. 此外，相鄰活躍度的組間，特征分布的區(qū)分度較低，分類邊界不清晰. 尤其輕度活躍組和中度活躍組的特征分布相似度非常高.

對(duì)各組間的局部時(shí)序特征計(jì)算巴氏距離(局部時(shí)序特征)，其定義為

(3)

式中：H為數(shù)值分布；γ為數(shù)值區(qū)間. 圖5中展示了各組間細(xì)胞形變局部時(shí)序特征的平均巴氏距離.

從圖5中可以看出，輕微活躍組和中度活躍組間的巴氏距離較大，說(shuō)明兩組中的特征分布情況相似. 高度活躍組的組內(nèi)巴氏距離相比于其他組較小，表明該組特征分布的組內(nèi)相似度低. 由此看出，數(shù)據(jù)集Ⅱ的細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變多分類問(wèn)題相對(duì)復(fù)雜，僅使用圖像特征度量全局形變難以有效解決此問(wèn)題. 通過(guò)提取形變過(guò)程中的時(shí)序信息和空間信息，所提特征算法能更好地度量和分類細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變.

4 結(jié) 論

針對(duì)顯微視頻中細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形變進(jìn)行研究，根據(jù)對(duì)細(xì)胞形變的觀察，提出一種針對(duì)細(xì)胞形變的局部時(shí)序特征，能夠有效提取細(xì)胞形變過(guò)程中時(shí)序信息和空間信息. 使用兩個(gè)淋巴細(xì)胞形變視頻數(shù)據(jù)集，對(duì)該特征算法的效果進(jìn)行了驗(yàn)證. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所提特征算法在兩個(gè)數(shù)據(jù)集上均有突出表現(xiàn)，能夠準(zhǔn)確度量和分類細(xì)胞動(dòng)態(tài)形變，相比于基于圖像特征的形變分析算法具有更大優(yōu)勢(shì).