郭凈潔，王 崇，張維甲，杜 超，李國林

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌，是最常見的口腔癌[1]。其復發(fā)率約為10%～30%,五年存活率為50%,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部侵襲是其預后不佳的主要原因[2-3]。因此如何有效地抑制癌細胞轉(zhuǎn)移是控制其復發(fā)、提高生存率的關(guān)鍵因素。

黃芩素(baicalein)和黃芩苷(baicalin)是從中藥黃芩的干燥根中提取的黃酮類單體，具有抗炎、抗氧化、保護心腦血管等作用[4]。黃芩中含量最高的黃酮類化合物為黃芩素，其與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合可形成黃芩苷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素進入動物體內(nèi)后，在血液中迅速轉(zhuǎn)換為黃芩苷及其他產(chǎn)物；黃芩苷口服后，需在腸道內(nèi)酶解為黃芩素方能吸收入血，進而轉(zhuǎn)化為黃芩苷[6]。近些年來,黃芩素和黃芩苷因有著較好的抗腫瘤效果，受到越來越多的關(guān)注[7]。王根桃等[8]發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過ERK-FAK信號通路來達到抑制口腔鱗癌的增殖能力。鐘文德等[9]證實黃芩苷可有效抑制人舌鱗癌細胞的遷移能力。有研究發(fā)現(xiàn)黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細胞有明顯的抑制作用[10]。而兩藥聯(lián)合作用于口腔鱗癌的研究在國內(nèi)外尚未見報道。此外,有文獻稱EMT在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起到重要作用[11]。因此本課題旨在探討黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗癌細胞增殖、遷移能力的影響，以及是否通過影響EMT進程來實現(xiàn)對口腔鱗癌的抑制作用。以期為口腔腫瘤的治療提供一種新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CAL-27口腔鱗癌細胞株為哈爾濱醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化中心實驗室細胞庫保存；黃芩素、黃芩苷(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)，DMEM、胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)；雙抗(GIBCO公司，美國)；胎牛血清(Biowest公司，美國)；二甲基亞砜(DMSO，國產(chǎn)分析純，上海國藥集團)；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，Sigma公司，美國)；E-鈣粘抗體(E-cadherin，Abcam公司，美國)；N-鈣粘抗體(N-cadherin，Abcam公司，美國)；酶標儀購自美國Biotek公司；超凈工作臺購自上海博迅實業(yè)有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要試劑的配制

黃芩素溶液：準確稱取20 mg黃芩素粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成 200 g/L的母液，0.22 μL孔徑濾器過濾，-20 ℃保存。

黃芩苷溶液：準確稱取20 mg黃芩苷粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成200 g/L的母液，0.22 μL孔徑濾器過濾，-20 ℃保存。

1.3 細胞培養(yǎng)

CAL-27細胞解凍后用含10%胎牛血清(FBS)和1%的雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞密度達到80%以上時，進行實驗。

1.4 方法

1.4.1 MTT實驗 CAL-27細胞(密度為8×103個/孔)接種于96孔板，孵育12 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分別加入200 μL不同濃度的黃芩素(50、100、150、200、300、400 mg/L)、黃芩苷(50、100、150、200、300、400 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)培養(yǎng)液，每組六個復孔，對照組不加藥。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，避光4 h。棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，慢速震蕩10 min。應(yīng)用酶標儀測定490 nm處的吸光度值(OD值)。

1.4.2 劃痕實驗 CAL-27細胞(密度為5×105個/孔)接種于6孔板中。孵育待貼壁細胞鋪滿六孔板底90%以上，用10 μL槍頭垂直孔板底部劃痕。PBS沖洗3遍，洗去脫落細胞，分別加入2 mL黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)的培養(yǎng)液，每組3個復孔。對照組不加藥，于0、6、12、24 h在倒置顯微鏡下拍照，觀察細胞愈合情況并計算細胞遷移率，公式如下：細胞遷移率(愈合率)=(T0時劃痕面積-Tt時劃痕面積)/T0時劃痕面積×100%。

1.4.3 免疫熒光實驗 CAL-27細胞(密度為4×104個/孔)接種于24孔板中，孵育12 h后，分別加入1 mL黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)的培養(yǎng)液，對照組不加藥，48 h后，Hoechst進行細胞核染色30 min，多聚甲醛溶液固定15 min，將固定的細胞與5%的BSA溶液避光封閉30 min，分別加入E-cadherin和N-cadherin抗體，4 ℃孵育過夜后加入熒光二抗，室溫避光孵育30 min，于熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.4.4 聯(lián)合指數(shù)(CI) 為了確定黃芩苷與黃芩素兩者聯(lián)合應(yīng)用是單純兩者藥效疊加作用還是協(xié)同作用，我們在本實驗中引入了Chou-Talady的中效原理計算CI，其計算公式為：

D1和D2是藥物1和藥物2聯(lián)合作用抑制率為50%時的藥物濃度，Dx1和Dx2是藥物1和藥物2分別單獨應(yīng)用時，抑制率為50%時的藥物濃度。根據(jù)Chou-Talady理論，如果CI=1，藥物聯(lián)合作用效果為疊加；CI<1，藥物聯(lián)合作用效果為協(xié)同；CI>1，藥物聯(lián)合作用效果為拮抗[12]。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果采用SPSS 19.0、 compusyn進行分析，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差。兩組間分析采用t檢驗，多組間分析應(yīng)用單因素方差分析，P<0.05視為有統(tǒng)計學意義，CI<1視為兩藥有協(xié)同作用。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素、黃芩苷及兩藥聯(lián)合時對CAL-27細胞增殖的影響

MTT實驗證明不同濃度的黃芩素、黃芩苷可以抑制CAL-27細胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(圖1a、1b)。計算得出，48 h時，黃芩素與黃芩苷的IC50值分別為170.5 mg/L和190.3 mg/L。選取空白對照組，黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)和兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)作用CAL-27細胞48 h，各組存活率分別為(46.96±6.89)%、(49.17±4.40)%、(31.87±4.98)%(圖1c)。聯(lián)合用藥與黃芩素、黃芩苷相比對CAL-27細胞增殖的抑制作用更強。差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.045，P=0.000 3，CI=0.552 31)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；a：黃芩素對CAL-27細胞活力的影響；b:黃芩苷對CAL-27細胞活力的影響；c:黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥對CAL-27細胞活力的影響

圖1不同用藥對細胞活力的影響

Fig.1Effects of different drugs on cell viability

2.2 黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥對CAL-27細胞的遷移能力的影響

劃痕實驗表明，6 h時，對照組愈合率為(23.8±1.6)%，黃芩素組愈合率為(10.9±2.9)%，黃芩苷組愈合率為(16.4±1.9)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(1.3±2.0)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.038，P=0.044，P=0.008)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.006,P=0.004)。12 h時，對照組愈合率為(42.7±1.7)%，黃芩素組愈合率為(19.4±1.6)%，黃芩苷組愈合率為(24.5±1.0)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(15±1.9)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.002,P=0.003,P=0.002)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.003,P=0.003)。24 h時，對照組愈合率為(72.9±0.7)%，黃芩素組愈合率為(36.2±1.9)%，黃芩苷組愈合率為(32.6±2.5)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(21±2.6)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.001,P=0.002,P=0.001)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.003,P=0.002)(圖2、3)。

2.3 黃芩素、黃芩苷及兩藥聯(lián)合時對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達影響

免疫熒光結(jié)果顯示黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥時與對照組相比，E-cadherin蛋白的表達升高，N-cadherin蛋白的表達降低。且兩藥聯(lián)合組較單藥組差異更為顯著(圖4、5)。

*：P<0.05；**：P<0.01

圖2黃芩素、黃芩苷作用于CAL-27的劃痕愈合率

Fig.2Scratch healing rates of the effect of baicalein, baicalin and their combination on CAL-27cells

圖3 劃痕實驗檢測CAL-27細胞的遷移能力( ×200)

圖4 免疫熒光實驗觀察CAL-27細胞E-cadherin蛋白表達情況

圖5 免疫熒光實驗觀察CAL-27細胞N-cadherin蛋白表達情況

3 討 論

口腔鱗癌是頜面部高發(fā)的惡性腫瘤，目前治療方法以綜合治療為主，其中晚期患者常發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，治療方案多為手術(shù)結(jié)合放、化療，其中化療是現(xiàn)在最為常用的口腔鱗癌輔助治療方法之一。傳統(tǒng)化療藥物在腫瘤治療中應(yīng)用廣泛且療效顯著，但存在許多不良反應(yīng)，如骨髓抑制，脫發(fā)及惡心、嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)。近年來，中藥提取物因其安全、低毒、高效的特點在腫瘤治療方面的應(yīng)用越來越廣泛，其中黃芩素、黃芩苷是從黃芩中提取的黃酮類單體，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等生物學活性，且對正常組織毒性小[13-14]。有研究顯示黃芩素、黃芩苷對結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等癌細胞的生長具有抑制作用[15-17]。然而近年來研究者除了關(guān)注單藥對腫瘤的抑制作用，開始對聯(lián)合用藥進行廣泛研究[18]，有報道稱在卵巢癌的治療中，姜黃素和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用比單獨用藥更有效，展現(xiàn)出協(xié)同作用[19]。黃芩素、黃芩苷與姜黃素和紫杉醇均為中藥提取物，因此，為探究中藥間的聯(lián)合用藥對口腔鱗癌的抑制效果，在體外條件下，本研究通過MTT、劃痕及免疫熒光實驗證實了黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥可以有效抑制CAL-27細胞的增殖和遷移能力。

黃芩素與黃芩苷可有效抑制CAL-27細胞的增殖，且抑制效果呈濃度依賴性，藥物濃度越高，抑制效果越好，當聯(lián)合用藥與黃芩素和黃芩苷的藥物濃度相同時，聯(lián)合用藥對CAL-27細胞增殖的抑制作用更好，且CI<1，表明黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同作用。Dou等[20]發(fā)現(xiàn)黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用可有效抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，這與本實驗結(jié)果一致。

腫瘤患者生存率低的重要原因之一是腫瘤細胞具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。因此抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是提高生存率的關(guān)鍵。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的遷移性研究中具有重要作用，這是一個由正常形態(tài)的上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有惡性潛能的間充質(zhì)細胞的過程[21]。其中E鈣粘蛋白(E-cadherin)和N鈣粘蛋白(N-cadherin)分別為EMT進程中上皮細胞和間充質(zhì)細胞的標志物。有研究表明，通過改變一些蛋白的表達可以引發(fā)或逆轉(zhuǎn)EMT進程，從而影響OSCC的遷移能力[22-23]。閆婉君等[24]研究證明黃芩素通過抑制Snail蛋白的表達阻止EMT發(fā)生從而抑制乳腺癌細胞的肝轉(zhuǎn)移，劉海霞等[25]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以抗腎小管纖維化，其機制是上調(diào)E-鈣粘蛋白的表達并抑制TGF-β1途徑阻斷腎小管細胞轉(zhuǎn)分化。既往實驗表明黃芩素、黃芩苷具有抗腫瘤遷移的作用，其機制可能是通過上調(diào)或下調(diào)EMT相關(guān)標志蛋白，抑制EMT進程。這與本實驗機制相類似，本研究通過劃痕實驗和免疫熒光實驗驗證了黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥可有效增強CAL-27細胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達并抑制N-cadherin蛋白的表達及遷移性，且聯(lián)合用藥對CAL-27細胞遷移的抑制作用強于單藥，提示腫瘤細胞惡性程度的降低可能與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白的逆向表達有關(guān)。

綜上所述，黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥對CAL-27細胞的增殖和遷移具有抑制作用，且抑制效果優(yōu)于黃芩素、黃芩苷單藥。本實驗結(jié)果為黃酮類藥物聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤的臨床治療提供了依據(jù)，但仍需探索更適宜的聯(lián)合用藥濃度。目前對黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥的研究仍處在體外實驗，體內(nèi)相關(guān)研究及其更多的作用機制有待進一步探索。