于 璐，白 華，龐 茜，朱 巖，張 康，邢繼紅，董金皋

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室/真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室，河北 保定 071000； 2.河北省農(nóng)藥發(fā)展與應(yīng)用協(xié)會，河北 石家莊 050031）

表觀遺傳學(xué)是近年來植物發(fā)育中的研究熱點，其中組蛋白修飾調(diào)控是表觀遺傳學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一，主要包括磷酸化（Phosphorylation）、甲基化（Methylation）、泛素化（Ubiquitylation）和乙酰化（Acetylation）等。組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰轉(zhuǎn)移酶共同完成的，其中組蛋白去乙?；瞧滟嚢彼釟埢囊阴；蝗ヒ阴；福℉DACs）清除，使組蛋白恢復(fù)正電荷與帶負電的DNA 緊密結(jié)合，松弛的核小體變得緊密，從而抑制了調(diào)控元件和DNA 的結(jié)合，進而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。HDA19 是擬南芥組蛋白去乙酰化酶RPD3/HDA1 超家族中的一員。研究已明確，HDA19 參與調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫反應(yīng)等過程［1］。擬南芥AtHDA19 的反義表達會增加組蛋白H4 的乙酰化水平，使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出早期衰老、鋸齒花環(huán)、空中花環(huán)結(jié)構(gòu)、開花延期等發(fā)育變態(tài)型［2-4］。AtHDA19 可通過抑制WRKY38 和WRKY62 的活性來調(diào)控PR1 的表達，參與SA 介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)，在植物抵抗細菌病原體侵染過程中發(fā)揮重要作用［5］。

TPL/TPRs 蛋 白（TOPLESS/TOPLESS-related proteins）是植物Grocho/Tup1 輔助抑制子家族成員，與酵母中Tup1 轉(zhuǎn)錄輔抑制因子同源，在多種生物途徑中作為通用輔助抑制因子［10］。TPL/TPRs 蛋白可以穩(wěn)定的與特異性的轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，抑制目標基因的表達，參與植物生理過程的調(diào)控［6］。TPL/TPRs 基因家族成員通過與乙烯反應(yīng)因子相關(guān)的反應(yīng)抑制基序（EAR 基序）相互作用，廣泛參與植物細胞周期調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)以及信號通路調(diào)節(jié)等生命進程［7］。擬南芥TPL/TPRs 有5 個家族成員，分別與TPL、TPR1、TPR2、TPR3 和TPR4，TPL/TPRs 家族成員之間存在一定的功能冗余和互補現(xiàn)象［8］。有研究報道，TPL/TPRs 和HDACs 一般以復(fù)合體的形式參與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，共同參與調(diào)控植物的生長發(fā)育［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，AtHDA19 與TPL-1 相互作用，參與調(diào)控擬南芥莖端的正常生長［11］。APETALA（AP2）通過招募TPL 和AtHDA19 來調(diào)控花發(fā)育中花器官相關(guān)基因的表達，影響花形態(tài)的建成［12］。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，ZmHDA101 與AtHDA19一致性最高且保守性較好。ZmHDA101 屬于RPD3/HDA1 型的，通過組蛋白修飾的序列特異性調(diào)控參與基因轉(zhuǎn)錄和植物生長。ZmHDA101 調(diào)控了玉米籽粒大小，是在整個發(fā)芽過程中都進行表達，對維持傳遞細胞特異基因在種子發(fā)育早期表達模式等植物生理發(fā)育方面十分重要［13-14］。目前，玉米ZmHDA101 與TPL/TPRs 之間的互作關(guān)系尚未見相關(guān)報道。本研究利用酵母雙雜交（Yeast two-hybrid, Y2H）技術(shù)，對ZmHDA101 與TPL/TPRs 之間的互作關(guān)系進行深入研究，為闡明ZmHDA101 在玉米生長發(fā)育和抵抗生物/非生物脅迫中的功能及其調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

酵母雙雜交載體PGADT7（AD）、PGBKT7（BD），酵母轉(zhuǎn)化菌株AH109、玉米自交系B73和擬南芥野生型Col-0 等，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室提供和保存。

1.2 ZmHDA101 的酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒，提取玉米自交系B73 的總RNA，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒，進行玉米cDNA 的合成。利用ZmHDA101基因的特異性上、下游引物（表1），以自交系B73 的cDNA 為模板，擴增ZmHDA101 基因全長。將ZmHDA101 與入門載體pBM27 連接，構(gòu)建該基因的入門載體pBM27-ZmHDA101，將測序正確的pCR8-ZmHDA101 與終載體AD、BD 進行LR 重組反應(yīng)，構(gòu)建ZmHDA101 基因的酵母雙雜交載體ADZmHDA101、BD-ZmHDA101。

1.3 TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒，提取擬南芥野生型Col-0 的總RNA，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒，進行擬南芥的cDNA 的合成。利用TPL/TPRs 的特異性上、下游引物（表1），擴增TPL/TPRs 的基因序列，并將其分別與入門載體pBM27 進行連接，轉(zhuǎn)化克隆測序后，獲得TPL/TPRs 的入門載體pBM27-TPL/TPRs；利用LR 重組試劑盒，將pBM27-TPL/TPRs 分別與AD、BD 進行重組反應(yīng)，經(jīng)菌落PCR 和測序鑒定后，獲得TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體AD-AtTPL、AD-AtTPR1、AD-AtTPR2、AD-AtTPR3、AD-AtTPR4 和BDAtTPL、BD-AtTPR1、BD-AtTPR2、BD-AtTPR3、BD-AtTPR4。

表1 試驗中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 ZmHDA101 和TPL/TPRs 的酵母自激活活性 檢測

取 預(yù) 冷 的BD-ZmHDA101、BD-AtTPL、BDAtTPR1、BD-AtTPR2、BD-AtTPR3、BD-AtTPR4和空BD 載體5 μL 分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH109，于SD/-Trp 固體培養(yǎng)基涂布，30 ℃下培養(yǎng)96 h 后，分別挑取單克隆接種于5 mL 的-Trp 液體培養(yǎng)基， 30 ℃ 200 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h，測OD600約等于0.7，稀釋到OD600為0.2，分別定量點于-Trp、-Trp/-His和-Trp/-His/+x-α-gal 培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落生長情況，確定ZmHDA101、TPL/TPRs的自激活活性。

1.5 ZmHDA101 與TPL/TPR 的酵母雙雜交試驗

按 質(zhì) 粒 濃 度 比1∶1 將AD-ZmHDA101 分 別與BD-AtTPL、BD-AtTPR1、BD-AtTPR2、BDAtTPR3 和BD-AtTPR4 質(zhì) 粒 混 合， 同 時 將BDZMHDA101 分 別 與AD-AtTPL、AD-AtTPR1、AD-AtTPR2、AD-AtTPR3 和AD-AtTPR4 的 質(zhì) ?；旌?。同時設(shè)置對照組合AD-ZmHDA101+BD、AD+BD-AtTPL、AD+BD-AtTPR1、AD+BDAtTPR2、AD+BD-AtTPR3、AD+BD-AtTPR4、BD-ZmHDA101+AD、BD+AD-AtTPL、BD+ADAtTPR1、BD+AD-AtTPR2、BD+AD-AtTPR3、BD+AD-AtTPR4 和AD+BD，將各個組合的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，于-Leu/-Trp 二缺固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)96 h 至長出酵母單克隆菌落，挑取單克隆置于-Leu/-Trp 二缺液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃ 200 r/min 震蕩培養(yǎng)至OD600為0.2 時，然后將菌液梯度稀釋10 倍和100 倍，分別吸取5 μL 點于-Leu/-Trp二缺、-Leu/-Trp/-His 三缺和-Leu/-Trp/-His+3-AT 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察酵母生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmHDA101 酵母雙雜交載體的構(gòu)建

使用ZmHDA101 基因的特異性引物擴增獲得ZmHDA101（1 554 bp）的基因片段（圖1A），回收目的片段后將其與入門載體pBM27 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌落PCR 鑒定獲得與目的片段大小一致的單一條帶（圖1B），進一步測序鑒定后獲得ZmHDA101 基因的入門載體pBM27-ZmHDA101。利用LR 重組試劑盒，將pBM27-ZmHDA101 分別與目標載體PGBKT7 和PGADT7進行重組反應(yīng)，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖1C）。經(jīng)測序鑒定后獲得目的載體ADZmHDA101、BD-ZmHDA101。

圖1 ZmHDA101 基因的酵母雙雜交載體構(gòu)建Fig.1 Yeast two-hybrid vector construction of ZmHDA101 gene

2.2 TPL/TPRs 酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用TPL/TPRs 的特異性上下游引物擴增獲得TPL/TPRs 的 目 的 片 段：AtTPL（1 032 bp）、AtTPR1（1 029 bp）、AtTPR2（1 005 bp）、AtTPR3（1 005 bp）和AtTPR4（1 032 bp），回收目的片段后分別進行克隆、測序，獲得TPL/TPRs 的入門載 體AtTPL-pBM27、AtTPR1-pBM27、AtTPR2-pBM27、AtTPR3-pBM27 和AtTPR4-pBM27（圖略）。將這些基因的入門載體分別與目標載體PGADT7和PGBKT7 進行LR 重組反應(yīng)，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖2）。經(jīng)測序鑒定后獲得TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體AD-AtTPL、BD-AtTPL、AD-AtTPR1、BD-AtTPR1、AD-AtTPR2、BDAtTPR2、AD-AtTPR3、BD-AtTPR3、AD-AtTPR4和BD-AtTPR4。

圖2 TPL/TPRs 的的酵母雙雜交載體構(gòu)建Fig.2 Yeast two-hybrid vector construction of TPL/TPRs

2.3 ZmHDA101、TPL/TPRs 的自激活活性檢測

對ZmHDA101、TPL/TPRs 的自激活活性進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化了BD-ZmHDA101、BDAtTPL、BD-AtTPR1、BD-AtTPR2、BD-AtTPR3、BD-AtTPR4 和空載體BD 的酵母均能夠在-Trp 培養(yǎng)基上生長良好，表明酵母轉(zhuǎn)化成功；轉(zhuǎn)化了BDAtTPR2 和BD-AtTPR4 的酵母均能夠在-Trp/-His和-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上生長良好，且在-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上顯藍色（見圖3），表明AtTPR2 和AtTPR4 具有自激活活性。

圖3 ZmHDA101、TPL/TPRs 的自激活活性檢測Fig.3 Self-activation activity of ZmHDA101 and TPL/TPRs

2.4 ZmHDA101 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交互作鑒定

利用酵母雙雜交技術(shù)，檢測ZmHDA101 與TPL/TPRs 蛋白之間的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同 轉(zhuǎn) 化 了ZmHDA101 與TPL/TPRs 組 合（ADZmHDA101+BD-AtTPL、BD-ZmHDA101+ADAtTPL、AD-ZmHDA101+BD-AtTPR1、BDZmHDA101+AD-AtTPR1、AD-ZmHDA101+BDAtTPR2、BD-ZmHDA101+AD-AtTPR2、ADZmHDA101+BD-AtTPR3、BD-ZmHDA101+ADAtTPR3、AD-ZmHDA101+BD-AtTPR4、BDZmHDA101+AD-AtTPR4） 的 酵 母 均 能 在-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 和-Leu/-Trp/-His+3-AT 培 養(yǎng)基上正常生長（圖4A），而轉(zhuǎn)化了對照組合的酵母 不能在-Leu/-Trp/-His 或-Leu/-Trp/-His+3-AT 培養(yǎng)基上正常生長（圖4B）。表明ZmHDA101 與AtTPL、AtTPR1、AtTPR2、AtTPR3 和AtTPR4 在酵母細胞中均能夠直接互作。

圖4 ZmHDA101 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交結(jié)果Fig.4 Yeast two-hybrid results of ZmHDA101 and TPL/TPRs

3 結(jié)論與討論

有研究報道，去乙酰轉(zhuǎn)移酶在抵抗生物、非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用［1,5］。AtHAD6 是病原體防御反應(yīng)的普遍抑制因子，在抑制和調(diào)控致病菌應(yīng)答基因的表達中起著重要的作用［20］。組蛋白去乙?；窰DA19 參與了抑制水楊酸（SA）介導(dǎo)的擬南芥防御反應(yīng)，AtHDA19 活性的喪失增加了SA 積累所需的一組基因的表達，通過將染色質(zhì)修飾成抑制狀態(tài)，可以確保防御基因的低基礎(chǔ)表 達［15］。過表達的AtHDA19 有效地消除了WRKY38和WRKY62 的轉(zhuǎn)錄激活活性，組蛋白脫乙酰酶催化從組蛋白尾中去除乙酰基，并通過減少轉(zhuǎn)錄因子對DNA 的訪問來抑制基因的轉(zhuǎn)錄，AtHDA19 可能通過物理作用而降低轉(zhuǎn)錄因子WRKY38 和WRKY62在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性［16］。AtHDA19 在調(diào)控植物生長發(fā)育、對非生物脅迫的響應(yīng)、對植物病原物侵染脅迫的應(yīng)答等方面均有重要功能［17］。擬南芥AtHDA19 參與擬南芥的生長發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫過程［2-5］。已有研究發(fā)現(xiàn)，AtHDA19 能與TPL 蛋白互作，參與調(diào)控擬南芥莖端生長和花形態(tài)的建成［11］。玉米ZmHDA101 與AtHDA19 同源，在玉米生長發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能及其調(diào)控機制尚未見相關(guān)報道。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，對ZmHDA101 與TPL/TPRs 之間的互作關(guān)系進行研究，確定了ZmHDA101 與TPL/TPRs 家族成員TPL、TPR1、TPR2、TPR3 和TPR4 均能在酵母細胞中直接互作，研究結(jié)果為闡明ZmHDA101在玉米生長發(fā)育和抵抗生物/非生物脅迫中的功能及其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

研究表明，植物轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子TPL/TPRs蛋白在植物信號通路中發(fā)揮著中心位置作用。TPL/TPR 與生長素信號通路組分之間的相互作用，主要與含有抑制區(qū)（RD）序列的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，是植物基因轉(zhuǎn)錄的通用抑制因子［18-19］。TPL/TPRs與HDACs 一般以復(fù)合體的形式參與到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，共同參與調(diào)控植物生長發(fā)育的［9-10］。水稻TPL/TPRs TPD 蛋白與核小體存在相互作用，TPD蛋白可以與組蛋白H3、H4 尾部多肽相互作用［4］。玉米ZmHDAC101 高度受到冷脅迫的誘導(dǎo)，與H3和H4 發(fā)生局部的去乙?；F(xiàn)象［20］。本研究確定了ZmHDA101 與TPL/TPRs 之間的相互作用，推測ZmHDA101 與TPL/TPRs 形成復(fù)合體影響組蛋白H3、H4 的去乙?；?，抑制相關(guān)基因的表達，參與玉米生長發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫過程。研究將進一步對ZmHDA101 調(diào)控的基因及其參與調(diào)控的植物抗病信號通路進行深入研究，為闡明ZmHDA101 在玉米生長發(fā)育和抵抗生物/非生物脅迫中的功能及其調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。