王海晶 王小軍

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)是指機(jī)械通氣48 h后至拔管后48 h內(nèi)出現(xiàn)的肺炎，是重癥患者最常見的的院內(nèi)感染。約10%～20%接受48 h以上的機(jī)械通氣的患者可能患VAP[1]。其實(shí)際死亡率仍存在爭議，如果初始治療不合適，其死亡率可超過50%[2]。由于VAP的實(shí)質(zhì)是多種病原體感染，故一般采用抗生素治療，且通常使用廣譜抗生素。若能夠知道污染的微生物的明確種屬，則可以降低廣譜抗生素的使用，以避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，以及減小藥物毒性[3-5]。一種基于分子的即時(shí)定量方法(實(shí)時(shí)定量PCR方法)可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)獲得細(xì)菌鑒定和定量信息，因此能夠?yàn)榕R床治療快速提供準(zhǔn)確的信息，在患病早期可進(jìn)行有效的和有針對(duì)性的抗生素治療。本研究在我院收治的疑似呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者中，采用氣管內(nèi)抽吸(Endotracheal Aspirate ，ETA)以及支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage ，BAL)兩種方式采集患者樣本[6]，使用常規(guī)微生物培養(yǎng)和實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行微生物分析，比較常規(guī)培養(yǎng)方法與實(shí)時(shí)定量PCR方法診斷VAP病原體的性能。

資料與方法

一、研究對(duì)象及樣本采集

選擇2016年2月～2018年5月在我院診治的患者。所有患者需插管并接受機(jī)械通氣治療至少48 h以上，且需符合以下所有標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡超過18歲，(2)影像學(xué)檢查可見新的浸潤性病變，體溫>38.3℃或<35.0℃，白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10 000/uL或<4500/uL和新發(fā)現(xiàn)的化膿性氣管分泌物。患有以下情況的病人需要被排除(1)患有嚴(yán)重的低氧血癥(PaO2/FiO2<100)，(2)免疫功能低下或中性粒細(xì)胞減少，(3)有難治性膿毒性休克[1]。

在符合本研究資格的112名患者中，78%的患者為男性，年齡中位數(shù)為62歲。其中74%的患者臨床肺部感染得分為6， 33.9%(38/112)的VAP病人在BAL和ETA收集的當(dāng)天接受β-內(nèi)酰胺類以及第三代頭孢菌素抗生素治療?？股刂委煹幕颊吆臀催M(jìn)行抗生素治療的患者沒有觀察到顯著的差異。

二、樣本采集

對(duì)于診斷為VAP的患者，在診斷當(dāng)天通過護(hù)士在無菌條件下將導(dǎo)管插入患者氣管30厘米處通過導(dǎo)管抽吸收集ETA樣本，之后收集BAL樣本[7]。BAL樣本收集采用支氣管鏡通過氣管導(dǎo)管穿過延長管引入到呼吸管中。在37℃條件下，使用20mL 生理鹽水分為五等份對(duì)葉片進(jìn)行灌洗，丟棄第一個(gè)灌洗樣品，不用于微生物學(xué)分析。BAL和ETA，分別取兩種樣品的一部分用于常規(guī)微生物分析，并將相同體積的剩余部分置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍，用于實(shí)時(shí)定量PCR分析。

三、方法

1 常規(guī)培養(yǎng)方法 采用《歐洲臨床微生物學(xué)手冊》推薦的方法進(jìn)行 BAL和ETA樣本的常規(guī)微生物學(xué)分析[8]。 ETA樣本振蕩混勻后，吸取100微升加入1mL無菌鹽水溶液進(jìn)行稀釋，吸取10uL該懸浮液接種于非選擇性(胱氨酸乳糖電解質(zhì)缺乏，COS)和選擇性(巧克力瓊脂)瓊脂平板在37℃下培養(yǎng)48 h。稀釋的目的是獲得103CFU/mL的檢測閾值。取10mL BAL原液直接接種在檢測閾值為102CFU/mL的相同瓊脂平板上。使用Vitek2系統(tǒng)，VitekMS系統(tǒng)或API試劑盒進(jìn)行細(xì)菌鑒定。BAL樣本中至少有一種病原體含量為104CFU/mL，而ETA為106CFU/mL，則該數(shù)據(jù)結(jié)果具有意義。

2 實(shí)時(shí)定量PCR方法 細(xì)菌DNA分批次進(jìn)行提取。所有樣本中添加確定含量的葡萄球菌(BAL為1500 CFU，ETA為7500 CFU)，用于樣本處理對(duì)照(Specimen Processing Control，SPC)。使用NucliSENS easyMag DNA試劑盒提取DNA ，洗脫體積為55 uL[9]。引物和探針用于檢測SPC和VAP中涉及的主要病原體。如金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，嗜血桿菌流感嗜血桿菌，奇異變形桿菌，大腸桿菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，肺炎鏈球菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌。采用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備每種病原體的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。如常規(guī)培養(yǎng)方法一樣，BAL樣本中至少有一種病原體含量為104CFU/mL，而ETA為106CFU/mL，數(shù)據(jù)結(jié)果才有意義。該方法對(duì)于每種病原體的檢測限為102CFU/mL，最低定量限為103CFU/mL，定量上限為107CFU/mL。

四、統(tǒng)計(jì)方法

本研究旨在評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)和常規(guī)培養(yǎng)方法在檢測VAP 患者ETA和BAL樣本細(xì)菌含量之間的差異。主要研究了三種主要盛行的病原體(金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌)，以常規(guī)培養(yǎng)法的微生物學(xué)結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)。通過受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic，ROC)來表示實(shí)時(shí)定量PCR法在檢測三種主要盛行的病原體的效果。常規(guī)微生物學(xué)方與實(shí)時(shí)定量PCR方法結(jié)果的決策閾值BAL為104CFU/mL，ETA為106CFU/mL，且在此閾值范圍上進(jìn)行BAL和ETA樣品之間的一致性評(píng)估。

結(jié) 果

一、樣本的采集

共收集了所有112個(gè)疑似VAP患者的BAL樣本，收集了101份ETA 樣本，由于部分樣本體積太小，而不能分析，故排除在外。在處理112例BAL樣本時(shí)，有一例沒有成功。因此提供了剩余111個(gè)BAL樣本的結(jié)果。在BAL樣本中，分別有77.6%和67.6%疑似VAP患者通過常規(guī)培養(yǎng)方法和qPCR證實(shí)。在ETA樣本中，分別有61.4%和63.4%疑似VAP患者通過常規(guī)培養(yǎng)和qPCR證實(shí)。在BAL和ETA樣本中，分別有45.9%和21.8%含有兩種或更多種微生物。主要分離的微生物是金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌。

二、疑似VAP患者BAL樣本中qPCR與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果的一致性

qPCR檢測BAL樣本中金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌的性能如(圖1A)所示以及相關(guān)的ROC曲線如(圖1B)所示。曲線下面積>0.86。在決策閾值(104CFU/mL)下測定金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌 qPCR的敏感度，分別為95.8%，100%和75.2%(表1)。其他不太普遍的病原體，如：敏感性大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌和奇異變形桿菌的比例>92%，肺炎鏈球菌達(dá)到85.3%。

圖1 qPCR與常規(guī)方法在疑似VAP患者BAL樣本微生物學(xué)分析的一致性及相關(guān)ROC曲線圖

(a)qPCR方法與常規(guī)培養(yǎng)法對(duì)于BAL 樣本中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌的結(jié)果一致性，兩種方法菌含量均取對(duì)數(shù)值，藍(lán)色代表一致的結(jié)果，紅色代表不一致的結(jié)果。(b)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌工作特征曲線圖。

表1 qPCR與常規(guī)方法在疑似VAP患者BAL樣本微生物學(xué)分析的一致性

三、疑似VAP的患者ETA樣本中qPCR與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果一致性

qPCR檢測ETA樣本中金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌的性能如(圖2a)所示以及相關(guān)的ROC曲線如(圖2b)所示。曲線下面積>0.91。銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌qPCR靈敏度為100%，但金黃色葡萄球菌較低80.2%(表2)。大多數(shù)細(xì)菌的qPCR特異性很高，范圍從89.5%到100%(表2)。

四、疑似VAP患者BAL與ETA的樣本微生物結(jié)果的一致性

BAL和ETA樣本的結(jié)果一致性計(jì)算主要參考三個(gè)目標(biāo)(金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌)以及兩種測試方法(常規(guī)方法和qPCR)。對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)和qPCR，樣本所有目標(biāo)微生物之間的一致性分別為55.8%和57.3%。對(duì)于金黃色葡萄球菌，常規(guī)方法一致性要好于qPCR ，分別為78.1%和68.7%。相反，對(duì)于銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌，qPCR比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，一致性更好，銅綠假單胞菌分別是88.7%和67.6%，流感嗜血桿菌分別為82.1%和63.9%。

圖2 qPCR與常規(guī)方法在疑似VAP患者ETA樣本微生物學(xué)分析的一致性及相關(guān)ROC曲線圖

(a)qPCR方法與常規(guī)培養(yǎng)法對(duì)于ETA樣本中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌的結(jié)果一致性，兩種方法菌含量均取對(duì)數(shù)值，藍(lán)色代表一致的結(jié)果，紅色代表不一致的結(jié)果。(b)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌工作特征曲線圖。

表2 qPCR與常規(guī)方法在疑似VAP患者ETA樣本微生物學(xué)分析的一致性

討 論

本研究人群主要是臨床疑似VAP的患者，其中有74%的患者臨床肺部感染得分>6，因此用于比較實(shí)時(shí)定量PCR法與常規(guī)微生物方法是比較可靠的。研究微生物快速診斷技術(shù)的意義在于可以為臨床診斷提供更加快速有效的微生物信息，以便有針對(duì)性的進(jìn)行治療，降低由于使用廣譜抗生素而導(dǎo)致的治療風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。

實(shí)時(shí)定量PCR方法可以直接測定細(xì)菌DNA來確定細(xì)菌種類，實(shí)驗(yàn)過程中在每個(gè)樣本中均加入對(duì)照，使用了半自動(dòng)化的提取流程，避免了高度手動(dòng)提取過程帶來的變異[13-14]，因此，與常規(guī)方法的結(jié)果較一致。本實(shí)驗(yàn)中BAL和ETA樣本中分別獲得了38和41個(gè)假陽性結(jié)果， DNA擴(kuò)增是qPCR的關(guān)鍵步驟，但是不能區(qū)分有活力和無活力的細(xì)菌，因此而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，是目前所有可用的qPCR方法的主要限制因素之一。因此，表明了定量PCR的重要性，可以減少假陽性的數(shù)量。盡管有假陽性，早期針對(duì)性的抗生素治療的益處高于抗生素過度使用的風(fēng)險(xiǎn)。在本研究中BAL樣本陰性預(yù)測值在95.2%和100%之間變化，ETA樣本在 93.7%和100%之間。以上結(jié)果表明了分子生物學(xué)技術(shù)的準(zhǔn)確性，以確認(rèn)沒有目標(biāo)菌。

實(shí)時(shí)定量PCR方法會(huì)受到閾值的影響，在研究中，標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本采用相同的閾值設(shè)置(BAL為104CFU/mL，ETA為106CFU/mL)，如果適當(dāng)調(diào)整閾值則結(jié)果有所改變。例如，對(duì)于ETA，閾值設(shè)置為105CFU/mL 代替106CFU/mL，可以顯著增加腸桿菌qPCR的靈敏度，從59.3%提高到91.7%。然而，閾值調(diào)整會(huì)降低特異性[15]。

本研究的結(jié)果表明可以使用分子生物學(xué)方法快速檢測疑似VAP的樣本，量化細(xì)菌DNA以便更好地評(píng)估細(xì)菌的致病性。本研究的目的是比較實(shí)時(shí)定量PCR方法和常規(guī)方法，是否適用于同一個(gè)病人兩種樣本(BAL和ETA)，即便只獲得了少量ETA樣本，依然可以使用分子方法。實(shí)時(shí)定量PCR法可以從兩種類型的標(biāo)本中識(shí)別和量化相同的病原體。

實(shí)時(shí)定量PCR方法也具有一定的局限性。首先，針對(duì)BAL樣本制備方案效率不高；第二，實(shí)時(shí)定量PCR僅限于檢測參與VAP的主要細(xì)菌；第三，本研究采用分子定量的方法應(yīng)用到VAP的微生物學(xué)診斷，未將體外研究的數(shù)據(jù)和結(jié)果在體內(nèi)領(lǐng)域進(jìn)行驗(yàn)證；第四，用于分子分析的樣品是凍存品，可能影響靈敏度和特異性；最后，微生物實(shí)驗(yàn)室使用分子方法來作為日常檢驗(yàn)方法，受到以下幾個(gè)因素的限制，如手動(dòng)步驟的數(shù)量，各提取批次微生物參考菌株的處理，用于量化的標(biāo)準(zhǔn)曲線等。

總之，本研究表明實(shí)時(shí)定量PCR方法診斷VAP患者病原體與常規(guī)微生物學(xué)方法的結(jié)果具有一致性，針對(duì)VAP中常見的病原體，實(shí)時(shí)定量PCR具有高度特異性和良好的敏感性，因此能夠提供可靠的定量微生物學(xué)數(shù)據(jù)。