高建全 張宇祥 呼玲玲 薛亞妮

肺癌(lung cancer)在男性所有腫瘤中發(fā)病率為第一位，在女性為第二位，而死亡率在男女中均為第一位[1]。每年全世界范圍內(nèi)肺癌死亡人數(shù)高達(dá)數(shù)百萬人[2]。肺癌根據(jù)病類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，NSCLC約占肺癌整體發(fā)病率的75%～80%。NSCLC確診時大多已發(fā)展為晚期或局部晚期，失去手術(shù)時機或手術(shù)效果較差，5年生存率不高。影響NSCLC患者預(yù)后的因素除了臨床分期外還與腫瘤病理類型、輔助治療等有關(guān)。近年來隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)某些基因的異常表達(dá)與患者的生存期明顯相關(guān)[3-4]。術(shù)后檢測這些基因的表達(dá)情況可作為NSCLC患者預(yù)后預(yù)測標(biāo)記物。既往研究顯示，MAGEA4基因在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，推測其和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。MAGEA4在肺癌報道不多，其表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系不詳。

資料與方法

一、MAGEA4基因表達(dá)水平

首先在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索NSCLC患者M(jìn)AGEA4mRNA的相對表達(dá)水平。數(shù)據(jù)集選擇條件為NSCLC，包括肺鱗癌和肺腺癌；同時比較MAGEA4基因在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中是否存在差異。存在差異表達(dá)的條件為MAGEA4基因mRNA上調(diào)或下調(diào)表達(dá)超過2倍(|Log2FC|>1)，且P<0.05。

二、 MAGEA4蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索MAGEA4 蛋白，物種選擇human, 限制條件為：相互作用蛋白不超過20個，置信度大于0.7，相互作用來源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系。

三、 MAGEA4功能和KEGG信號通路富集

采用基因本體論(GO)和京都百科全書(KEGG)對MAGEA4及其相關(guān)基因功能和信號通路進(jìn)行富集。GO富集包括生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能。

四、 MAGEA4基因共表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫中，采用linkedomics在線分析軟件[6]，分析TCGA數(shù)據(jù)中與MAGEA4正負(fù)相關(guān)表達(dá)的基因，同時對與MAGEA4基因存在相關(guān)性的基因進(jìn)行聚類。選取正相關(guān)和負(fù)相關(guān)表達(dá)最為明顯的2個基因進(jìn)行分析，計算spearman相關(guān)系數(shù)。

五、 生存分析

根據(jù)MAGEA4基因mRNA表達(dá)的中位數(shù)，將NSCLC患者分為高低表達(dá)組，采用風(fēng)險比例模型繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗，比較高低表達(dá)組NSCLC預(yù)后是否存在差異。

六、免疫組化

回顧性分析我院手術(shù)治療的68例NSCLC的組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測患者癌組織中MAGEA4蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，對前述生物信息分析結(jié)果進(jìn)行驗證。免疫組織化學(xué)檢測MAGEA4蛋白表達(dá)按試劑盒操作說明進(jìn)行。

七、 MAGEA4蛋白高低表達(dá)評價

隨機選取3個高倍視野進(jìn)行染色強度和陽性細(xì)胞百分比計數(shù)。細(xì)胞無染色=0分，細(xì)胞著色為淺黃色=1分，細(xì)胞著色為棕黃色=2分，細(xì)胞著色為棕褐色=3分；陽性細(xì)胞比例評分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%=0分；10～25%=1分； 26～50%=2分；51～75%=3分；陽性>75%=4分?？傮w評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強度評分；最終評判：<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

八、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、MAGEA4基因表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫中，MAGEA4基因mRNA在NSCLC患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)(圖1A)。但MAGEA4基因mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者臨床分期并無明顯關(guān)系 (P>0.05)(圖1B)。

二、MAGEA4蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

與MAGEA4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共21個蛋白節(jié)點，112個edges，平均節(jié)點度為10.7，區(qū)域聚類指數(shù)為0.90，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集明顯(P<0.05)(圖2)。

圖1 MAGEA4基因mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平

(A: MAGEA4基因mRNA在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較；B：MAGEA4基因mRNA表達(dá)與NSCLC患者的床分期的關(guān)系)

圖2 與MAGEA4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信號通路網(wǎng)絡(luò)(PPI)

三、MAGEA4基因共表達(dá)分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，我們對與MAGEA4共表達(dá)的相關(guān)基因進(jìn)行了分析，并繪制了共表達(dá)熱圖(圖3)。其中正相關(guān)表達(dá)最為顯著的基因為MAGEA410(r=0.80,P<0.05)，而負(fù)相關(guān)表達(dá)最為顯著的基因為DE4D (r=-0.37,P<0.05)(圖4)。

四、功能富集

MAGEA4生物學(xué)過程、細(xì)胞成分及分子功能分別主要富集于磷脂酰肌醇3激酶結(jié)合、細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)復(fù)合物和核苷酸受體活性(表1)。

五、KEGG信號通路

MAGEA4及相關(guān)共表達(dá)基因KEGG信號通路主要富集于Notch信號通路、維生素代謝信號通路和DNA復(fù)制相關(guān)信號通路等(圖5)。

六、生存分析

MAGEA4基因mRNA高表NSCLC患者總生存低于低表達(dá)患者(HR=1.3, 95%CI:1.04～3.21,P<0.05)圖6A；而高低表達(dá)組無疾病進(jìn)展生存無統(tǒng)計學(xué)差異(HR=0.82, 95%CI:0.36～1.94,P>0.05)(圖6B)。

圖3 MAGEA4基因共表達(dá)分析熱圖(A:正相關(guān)基因共表達(dá)熱圖；B: MAGEA4共表達(dá)負(fù)相關(guān)基因熱圖)

圖4 MAGEA4共表達(dá)正負(fù)相關(guān)基因散點圖

(A: MAGEA410基因與MAGEA4正相關(guān)； B:PDE4D與MAGEA4基因負(fù)相關(guān))

表1 MAGEA4生物學(xué)過程、細(xì)胞成分及分子功能富集

七、免疫組化MAGEA4蛋白表達(dá)情況

免疫組化顯示MAGEA4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒(圖7)。NSCLC患者癌組織中MAGEA4蛋白高表達(dá)者為52.9%(36/68)顯著高于癌旁組織23.5%(16/68)P<0.05。

八、MAGEA4蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系

MAGEA4蛋白表達(dá)水平與NSCLC患者腫瘤分化程度(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)存在相關(guān)性，MAGEA4蛋白高表達(dá)者腫瘤分化程度較低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高(表2)。

討 論

黑色素瘤抗原基因家族A(MAGEA)從MAGEA1到magea12共有12個亞型[7]。MAGEA4是MAGEA基因家族的一員，這個家族的成員相互編碼具有50%到80%序列一致性的蛋白質(zhì)。MAGEA

圖5 MAGEA4及相關(guān)基因功KEGG信號通路柱狀圖

圖6 MAGEA4基因mRNA表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系曲線

(A: MAGEA4基因mRNA表達(dá)與NSCLC患者總生存; B：MAGEA4基因mRNA表達(dá)與NSCLC患者無疾病進(jìn)展生存)

圖7 MAGEA4蛋白表達(dá)免疫組化分析

表2 MAGEA4蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系

基因的啟動子和第一外顯子表現(xiàn)出相當(dāng)大的變異性，這表明該基因家族的存在使得能夠在不同轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)相同的功能[8]。MAGEA基因定位于Xq28區(qū)，各區(qū)域基因與某些遺傳性疾病有關(guān)，如先天性角化不良與該基因的突變有關(guān)。

有報道表明，MAGEA基因在不同類型的癌癥中表達(dá)上調(diào)，如淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和其他實體惡性腫瘤[9]。 已有研究顯示MAGEA4是在口腔鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有表達(dá)上調(diào)[9-10]。因而，MAGEA4在上述實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。MAGEA亞家族蛋白具有高度保守性，很難獲得只識別一個家族成員的特異性抗體，例如，MAGEA4和MAGEA10蛋白質(zhì)在氨基酸水平上具有50%以上的序列同源性，但具有不同的大小和細(xì)胞定位[11]。免疫組化研究中使用的幾種抗體與許多MAGEA蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，在多種癌癥類型中都可見到，定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，這使得腫瘤組織的免疫組化分析變得復(fù)雜，這些成員可能具有不同的表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位和對惡性腫瘤的影響[12]。但MAGEA4基因的確切分子生物學(xué)功能不清。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MAGEA4基因功能主要富集于磷脂酰肌醇3激酶結(jié)合、細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)復(fù)合物和核苷酸受體活性。因此，提示MAGEA4基因及其表達(dá)產(chǎn)物可能通過上述功能在腫瘤中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。KEGG信號通路富集顯示，MAGEA4及相關(guān)共表達(dá)基因主要富集于Notch信號通路、維生素代謝信號通路和DNA復(fù)制相關(guān)信號通路等。Notch信號影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成。Notch基因位點突變引起的表型改變，表明Notch信號作用的多樣性因此，MAGEA4基因可能通過Notch信號通路影響腫瘤細(xì)胞的凋亡與增殖，從而影響患者的預(yù)后[13- 14]。同時，我們采用免疫組織化學(xué)法檢測了68例NSCLC患者的癌組織，發(fā)現(xiàn)MAGEA4基因高表達(dá)與患者的腫瘤分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，MAGEA4基因高表達(dá)者腫瘤分化較差，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤較高，這些危險因素也符合患者預(yù)后不良的生物學(xué)特征。