古孜麗阿依·庫(kù)爾班,黃 卉,陳 偉,朱倩蘭,武嘉林,*
(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊830011; 2.新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司,新疆 烏魯木齊830011; 3.新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司,新疆 烏魯木齊830011)
阿膠強(qiáng)骨口服液是新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方制劑,由熟地黃、黃芪、黨參、枸杞、阿膠、牡蠣等6味藥材組成。目前,阿膠強(qiáng)骨口服液采用傳統(tǒng)的加熱回流提取技術(shù),存在提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗大、溶劑用量大和回收率低等缺點(diǎn)。連續(xù)逆流提取技術(shù)是使溶劑和藥材反方向流動(dòng),兩者逆流接觸,濃度梯度可以始終保持在較高水平,確保連續(xù)而充分的接觸提取,具有浸出速度快、提取效率高、能耗小等特點(diǎn)[1-4]。作者采用連續(xù)逆流提取技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的加熱回流提取工藝,以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標(biāo),采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。
黃芪(批號(hào)190802,哈巴河)、黨參(批號(hào)190808,甘肅)、枸杞子(批號(hào)190801,精河)、熟地黃(批號(hào)190401,河南)、阿膠(批號(hào)19030112,山東)、牡蠣(批號(hào)1908001,東北),百草堂公司;阿膠強(qiáng)骨口服液(批號(hào)18101402、18100501),新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司;黃芪甲苷(110781-201717)、毛蕊花糖苷(111530-2017-13)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(111920-201606)、D-無水葡萄糖(110833-201707),中國(guó)食品藥品檢定研究院。
三氯甲烷,分析純,天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)開發(fā)有限公司;正丁醇、硫酸,分析純,成都科隆化學(xué)品有限公司;氨水,分析純,四川西隴科技有限公司;甲醇、乙腈,色譜級(jí),賽默飛世爾科技有限公司;甲酸,分析純,天津福晨化學(xué)試劑廠;冰乙酸,分析純,天津永晟精細(xì)化工有限公司;苯酚、無水乙醇,分析純,天津百世化工有限公司。
LC-20AD型高效液相色譜儀、UV-2600型紫外可見分光光度計(jì),日本島津;蒸發(fā)光散射器,天津埃文森;CPA225D型電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Smart-S15UV型超純水器,上海和泰儀器有限公司;SK3300LHC型超聲波清洗器,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;連續(xù)逆流提取小機(jī),江蘇沙家浜醫(yī)藥化工裝備股份有限公司;XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋,北京永光明醫(yī)療儀器有限公司;GENIUS 4K型臺(tái)式低速離心機(jī),長(zhǎng)沙鑫奧儀器儀表有限公司。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取適量毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品,加入甲醇溶解,搖勻,制成0.268 mg·mL-1的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,冷藏,備用。
1.2.2 供試溶液的制備
精密量取10 mL阿膠強(qiáng)骨口服液置于具塞錐形瓶中,加入20 mL甲醇,超聲10 min后,冷卻,過濾;濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得供試溶液。
1.2.3 色譜條件
Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84,體積比,下同),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品,加入甲醇溶解,搖勻,制成0.251 5 mg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,冷藏,備用。
1.3.2 供試溶液的制備
精密量取5 mL阿膠強(qiáng)骨口服液置于25 mL容量瓶中,加入甲醇,定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得供試溶液。
1.3.3 色譜條件
Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。梯度洗脫條件見表1。
表1梯度洗脫條件
Tab.1 Gradient elution conditions
1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg置于25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,充分混勻,制成0.5 mg·mL-1的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.4.2 供試溶液的制備
精密吸取阿膠強(qiáng)骨口服液10 mL置于分液漏斗中,分別用40 mL、30 mL三氯甲烷萃取2次,棄去下層;分別用40 mL、40 mL、30 mL、20 mL水飽和的正丁醇萃取4次,收集合并正丁醇液(上層);再分別用50 mL、40 mL氨試液洗滌2次,棄去氨水層(下層);正丁醇液減壓回流,濃縮至干,冷卻,殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ葜? mL容量瓶中,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得供試溶液。
1.4.3 色譜條件
Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),蒸發(fā)光散射器檢測(cè),流動(dòng)相為乙腈-水(38∶62),漂移管溫度105 ℃,流速3.0 L·min-1,撞擊器關(guān)閉,理論塔板數(shù)按黃芪甲苷計(jì)算不低于4 000,進(jìn)樣量10 μL。
1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取10 mg D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中,加水溶解,并定容至刻度,搖勻,即得0.1 mg·mL-1的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,冷藏,備用。
1.5.2 供試溶液的制備
精密吸取阿膠強(qiáng)骨口服液1 mL置于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。精密量取0.5 mL,加無水乙醇9.5 mL,4 000 r·min-1離心15 min,傾去上清液,加純化水溶解沉淀,并定容至25 mL容量瓶中,即得供試溶液。
1.5.3 5%苯酚溶液的配制
精密稱取苯酚固體5.0 g,加水溶解,定容至100 mL棕色容量瓶中,搖勻,即得5%苯酚溶液。
1.5.4 測(cè)定方法
精密吸取供試溶液2.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,搖勻;迅速加入硫酸5.0 mL,搖勻,靜置10 min;40 ℃水浴鍋中保溫15 min,取出,迅速置于冷水中冷卻至室溫,以相應(yīng)的試劑為空白,在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。
在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及原工藝的基礎(chǔ)上,以料液比(g∶mL,下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及提取溫度為考察因素,以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),設(shè)定其加權(quán)平均數(shù)均0.2,采用綜合加權(quán)評(píng)分法,優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2。
表 2正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平
Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiments
2.1.1 高效液相色譜圖
取毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試溶液按1.2.3色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果見圖1。
圖1 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectra of verbascoside standard solution(a) and test solution(b)
2.1.2 線性關(guān)系
分別取268 μg·mL-1、134 μg·mL-1、67 μg·mL-1、33.5 μg·mL-1、16.75 μg·mL-1、8.375 μg·mL-1的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性方程為:y=13088x+6196.3(R=0.9995)。表明毛蕊花糖苷濃度在8.375~268 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.1.3 精密度
精密吸取134 μg·mL-1毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.24%,表明儀器精密度良好。
2.1.4 重復(fù)性
取阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402)6份,按1.2.2方法制備供試溶液,按1.2.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.47%,表明該方法重復(fù)性好。
2.1.5 穩(wěn)定性
取阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402),按1.2.2方法制備供試溶液,分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.2.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.63%,表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.6 加標(biāo)回收率
取已知含量的阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402)6份,加入一定量的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.2方法制備供試溶液,按1.2.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示,平均加標(biāo)回收率為105.17%,RSD為1.11%。
2.2.1 高效液相色譜圖
取毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試溶液按1.3.3色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果見圖2。
圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC spectra of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside standard solution(a) and test solution(b)
2.2.2 線性關(guān)系
分別取125.75 μg·mL-1、62.88 μg·mL-1、31.44 μg·mL-1、15.72 μg·mL-1、7.86 μg·mL-1、3.93 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性方程y=45232x+18634(R=0.9996)。表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度在3.93~125.75 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.2.3 精密度
精密吸取50.3 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.55%,表明儀器精密度良好。
2.2.4 重復(fù)性
取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501)6份,按1.3.2方法制備供試溶液,按1.3.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.43%,表明該方法重復(fù)性好。
2.2.5 穩(wěn)定性
取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501),按1.3.2方法制備供試溶液,分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.3.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.92%,表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 加標(biāo)回收率
取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501)6份,每份加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.2方法制備供試溶液,按1.3.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示,平均加標(biāo)回收率為96.23%,RSD為2.9%。
取4 000支阿膠強(qiáng)骨口服液處方量的熟地黃、黨參、黃芪、枸杞、阿膠、牡蠣,置于連續(xù)逆流提取設(shè)備中提取,收集提取液,減壓回收乙醇,濃縮至一定比重的浸膏,其余步驟按原工藝進(jìn)行配制口服液。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表3,方差分析見表4。
以綜合評(píng)分為考察指標(biāo),采用極差直觀分析4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響大小依次為D>C>B>A;方差分析結(jié)果顯示,D因素有極顯著性差異,C因素有顯著性差異。結(jié)合直觀分析,確定連續(xù)逆流最佳提取工藝為A1B1C2D3,即料液比1∶6、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間120 min、提取溫度80 ℃。
表 3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiments
表 4方差分析
Tab.4 Variance analysis
注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。
稱取處方量的各個(gè)藥材,按最佳提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得毛蕊花糖苷含量分別為25.75 μg、22.24 μg、28.05 μg;毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分別為87.9 μg、70.84 μg、92.21 μg;黃芪甲苷含量分別為111.34 μg、94.58μg、121.26 μg;總多糖含量分別為15.41 mg、13.35 mg、17.93 mg。表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。
阿膠強(qiáng)骨口服液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z2000039)是由新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司研發(fā)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及小兒佝僂病的一款經(jīng)典中藥制劑,其以獨(dú)特的作用機(jī)理和顯著的臨床療效廣受患者青睞。作者所在課題組擬對(duì)阿膠強(qiáng)骨口服液進(jìn)行創(chuàng)新再評(píng)價(jià)研究。將從藥物生產(chǎn)工藝、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(雜皮膠源阿膠質(zhì)量監(jiān)控)等方面對(duì)阿膠強(qiáng)骨口服液進(jìn)行再評(píng)價(jià)研究,以期對(duì)該口服液進(jìn)行守正創(chuàng)新,獲得一款療效確切、質(zhì)量可靠、技術(shù)工藝先進(jìn)的新型阿膠強(qiáng)骨口服液。
根據(jù)新頒中醫(yī)藥法中藥再評(píng)價(jià)是作為打破傳統(tǒng)中藥品種多、小、散、亂、全格局的必要途徑。目前我國(guó)中藥品種9 000多種,批號(hào)近6萬個(gè),生產(chǎn)廠家近4 000家,行業(yè)集中度低,低水平重復(fù),產(chǎn)品缺少深入研發(fā)。改變這種格局需要設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)施嚴(yán)格、結(jié)果可信的上市后的藥物再評(píng)價(jià)研究,需要經(jīng)得起考驗(yàn)的再評(píng)價(jià)循證證據(jù)。相比于傳統(tǒng)的加熱回流提取方式,新型連續(xù)逆流提取顯著改善了阿膠強(qiáng)骨口服液提取效率及提取溶劑的回收率,提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改善是我國(guó)中藥做強(qiáng)做大的主攻方向。
本研究新增4種質(zhì)控指標(biāo)作為阿膠強(qiáng)骨口服液新型連續(xù)逆流提取工藝的監(jiān)控指標(biāo),不僅對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)和藥效具有指導(dǎo)作用,還給我國(guó)已上市產(chǎn)品再評(píng)價(jià)給出了參考。
以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標(biāo),采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。結(jié)果表明,4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響大小依次為:提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比,確定最佳提取工藝為:料液比1∶6(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間120 min、提取溫度80 ℃。