曹順順， 汪曉龍， 舒?zhèn)骼^， 邵劍杰

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，湖北 黃石（435002）

舌鱗癌是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一，與口咽癌位列全身惡性腫瘤的第6 位［1-2］。舌鱗癌的發(fā)病原因尚未明確，但是研究表明，吸煙、嗜酒等因素與舌鱗癌的發(fā)生有關(guān)［3］。目前臨床上對(duì)于舌鱗癌的治療以手術(shù)為主輔以放化療的綜合治療，但目前治療效果有限，因此研究藥物對(duì)于舌鱗癌的治療作用對(duì)于舌鱗癌的防治具有重要意義。

塞萊昔布（celecoxib，CELE）是臨床上常用的非甾體抗炎藥物，是環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase Ⅱ，COX-2）的選擇性抑制劑，具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛的作用［4-5］。大量研究表明CELE 對(duì)肝癌［6］、胃癌［7］、肺癌［8］、結(jié)腸癌［9］等多種惡性腫瘤具有抑制作用。美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)家族性結(jié)腸腺瘤性息肉病人口服COX-2 抑制劑塞來昔布，用于預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生［10］。目前關(guān)于CELE 抑制舌鱗癌增殖的研究報(bào)道較少，因此本實(shí)驗(yàn)探討CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 增殖的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為CELE 防治舌鱗癌提供臨床前研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。CELE（純度＞99%，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司，貨號(hào)：C129279）；c-Myc、Cyclin D1、β-actin 上下游引物和探針由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；抑癌基因PTEN（9188）兔單克隆抗體、p-AKT（Thr308）（13038）兔單克隆抗體、原癌基因c-Myc（5605）兔單克隆抗體、G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1，2978）兔單克隆抗體、β-actin（4970）兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG 二抗（7074）等購(gòu)自美國(guó)CST 公司。全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀（xMark）、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器（TC20）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX96）等購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（G：BOX，SYNGENE 公司，英國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測(cè)CELE對(duì)Cal-27細(xì)胞的毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按4 000 個(gè)/孔，將Cal-27 細(xì)胞接種到96 孔板中，每孔體積為100 μL；設(shè)置空白組（無Cal-27，僅DMEM 培養(yǎng)基）、對(duì)照組（0 μmol/L）及不同濃度（10、20、40、60、80、100 μmol/L）的實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率［（A給藥-A空白）/（A對(duì)照-A空白）× 100%］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1 × 105個(gè)/孔接種于培養(yǎng)皿中，根據(jù)CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)對(duì)照組（0 μmol/L）及CELE 實(shí)驗(yàn)組（10、20、40 μmol/L），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移 采用Transwell 6 孔板試劑盒檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，按照試劑盒的說明書要求，首先配置基質(zhì)膠，與預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)基混合，均勻鋪在Transwell 侵襲上室，37 ℃條件下孵育2 h，然后Transwell 上室每孔計(jì)入200 μL/孔不含血清的DMEM 培養(yǎng)液，Transwell 下室加入混有10%胎牛血清的DMEM，每孔500 μL。37 ℃的孵育箱孵育24 h，加入結(jié)晶紫染色試劑，孵育15 min，后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)c-Myc、Cyclin D1 的mRNA 表達(dá)水平 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Cal-27 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行分組給藥，運(yùn)用RNA 提取試劑提取Cal-27 細(xì)胞RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Cal-27 細(xì)胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)水平。PCR 擴(kuò)增條件（反應(yīng)體系為20 μL）：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：β-actin（330 dp）：正向：5′-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3′，反向：5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′；c-Myc（133 dp）：正向：5′-TCGGAAGGACTATCCTGCTG-3′，反向：5′-GTGTGTTCGCCTCTTGACATT-3′ ；Cyclin D1（218 dp）：正向：5′-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3′；反向：5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) Cal-27 細(xì)胞經(jīng)不同劑量（10、20、40 μmol/L）CELE 給藥作用24 h 后，以及經(jīng)40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h 后，加入蛋白抽提試劑提取Cal-27 細(xì)胞蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量。分別取Cal-27 細(xì)胞蛋白樣品40 μg，經(jīng)過Tris-HCl 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜（0.45 μm）上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）、磷酸化蛋白 激 酶B（phospho - protein kinase B，p - AKT）（Thr308）、原癌基因蛋白c-Myc、G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）等一抗（1∶1 000）在4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜，TBST 清洗3 次，每次10 min，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 顯色后運(yùn)用G：BOX 成像分析系統(tǒng)獲得條帶，以β-actin 作為內(nèi)參。采用Image J 圖像軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞增殖的抑制作用

運(yùn)用CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)法檢測(cè)CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖1 所示。隨著CELE給藥濃度增大，Cal-27 細(xì)胞存活率依次降低，同一濃度給藥時(shí)間增長(zhǎng)，Cal-27 細(xì)胞存活率也隨之降低。當(dāng)CELE 濃度為60 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 細(xì)胞存活率分別為68.5%、60.0%，當(dāng)CELE 濃度為40 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 細(xì)胞存活率為80.0%、75.0%，表明高劑量（＞40 μmol/L）CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞具有明顯的抑制作用，因此選擇10、20、40 μmol/L 對(duì)細(xì)胞存活率影響較小的劑量作為CELE 的給藥劑量進(jìn)行下一步的研究。

2.2 不同濃度CELE 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞的遷移能力比較：對(duì)照組＞10 μmol/L CELE 組＞20 μmol/L CELE 組＞40 μmol/L CELE 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

Figure 1 CCK-8 assay to detect the effect of different concentration of CELE on the survival rate of Cal-27 cells圖1 CCK-8 檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度的CELE 對(duì)Cal-27細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度CELE 對(duì)c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)的影響

結(jié)果如圖3 所示，與對(duì)照組比，不同濃度CELE給藥作用后c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)水平均降低，且結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6.584、7.125，P＜0.05）。表明CELE 能夠抑制c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)從而對(duì)Cal-27 細(xì)胞增殖具有抑制作用。

2.4 不同濃度CELE 對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不同濃度CELE 給藥作用后檢測(cè)PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)情況，與對(duì)照組比，不同劑量CELE 給藥組的p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)均下降，PTEN 的表達(dá)均上升（F＝6.103，P＜0.05），見圖4。

檢測(cè)40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，與對(duì)照組比，CELE 給藥后隨著時(shí)間的推移，p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)逐漸下降，PTEN 的表達(dá)逐漸升高（F＝5.835，P＜0.05），見圖5。表明CELE 能夠激活PTEN 信號(hào)通路抑制p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制Cal-27 細(xì)胞增殖。

3 討 論

Figure 2 The effect of different concentrations of CELE on Cal-27 cell invasion（× 200）圖2 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞侵襲的影響（× 200）

Figure 3 The effect of CELE on c-Myc, Cyclin D1 mRNA expression in Cal-27 cells圖3 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)的影響

Figure 4 Effects of different concentrations of CELE on the expression of cell proliferation related proteins PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells圖4 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表達(dá)的影響

Figure 5 Effects of 40 μmol/L CELE on the expression of PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells at different time圖5 40 μmol/L CELE 作用不同時(shí)間對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表達(dá)的影響

CELE 作為一種臨床上用于抗炎鎮(zhèn)痛的藥物，研究表明其能夠激活PTEN 信號(hào)通路抑制AKT 信號(hào)通路，對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 的抑制作用。研究結(jié)果表明，不同濃度的CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 均具有一定的增殖抑制作用，同時(shí)不同劑量CELE 作用24 h 及相同劑量CELE 作用不同時(shí)間均能夠激活PTEN 從而抑制AKT 活化抑制c-Myc、Cyclin D1 的表達(dá)從而抑制舌鱗癌細(xì)胞Cal-27增殖。

PTEN 是機(jī)體內(nèi)的抑癌基因，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有負(fù)調(diào)節(jié)作用［12］。研究表明在舌鱗癌中PTEN失活，具有促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖及抗凋亡的作用［13］。PTEN 失活能夠使其下游AKT 磷酸化水平增加其中主要是p-AKT（Thr308）磷酸化水平增加從而激活A(yù)KT 信號(hào)通路，AKT 信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能量代謝、增殖、抗凋亡等相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［14］。Li 等［15］研究表明過表達(dá)AKT 能夠誘導(dǎo)形成肝癌，同時(shí)等研究表明沉默PTEN 基因的表達(dá)能夠激活A(yù)KT 信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤的形成、發(fā)生和發(fā)展。c-Myc、Cyclin D1 是AKT 信號(hào)通路下游重要的增殖相關(guān)基因，c-Myc 能夠參與介導(dǎo)細(xì)胞外的傳入生物信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡［16-18］。Liu 等［19］研究表明c-Myc 過表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化從而形成腫瘤。Cyclin D1 是影響腫瘤細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子［20］。PTEN 失活能夠激活A(yù)KT 信號(hào)通路從而調(diào)控c-Myc、Cyclin D1 的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化具有重要作用。

綜上所述，CELE 作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 增殖具有抑制作用，表明CELE 對(duì)于防治舌鱗癌具有一定的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。