魏曉梅，楊文敏，聶賢鋒，吳麗芳

(曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南 曲靖 655011)

金銀花(LonicerajaponicaThunb.)屬忍冬科，多年生半常綠纏繞及匍匐灌木，唇形花有淡香，初夏開(kāi)花，開(kāi)放前采收干燥，屬?lài)?guó)家名貴藥材之一。我國(guó)金銀花主要產(chǎn)于山東平邑、蒼山、費(fèi)縣和河南新密、鞏義、登封等地[1]。金銀花多糖具有抗凝血[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒、抗輻射、降血壓、降血糖、降血脂[5]等多種作用，是一類(lèi)重要的生物活性物質(zhì)[6]。劉蓓等發(fā)現(xiàn)金銀花多糖濃度10～250 ug/ml時(shí)可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖[7]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. chen ex C. H.)屬五加科多年生草本植物，根狀莖呈圓柱形，塊根及花都有很高的藥用價(jià)值[8]，三七的研究重點(diǎn)主要在三七總皂苷領(lǐng)域[9]。此外，三七多糖也是三七中重要的活性成分[10]，在免疫調(diào)節(jié)上具有很大優(yōu)勢(shì)[11]，且具有較強(qiáng)的清理ABTS和DPPH自由基的能力，抗氧化活性較高[12]。因此，三七及金銀花多糖因其藥用價(jià)值被作為研究熱點(diǎn)，如劉杰[13]對(duì)土三七的多糖提取方法及成分進(jìn)行了詳細(xì)探索。殷紅梅等[14]對(duì)金銀花多糖提取過(guò)程中脫蛋白的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。趙鵬等[15]用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的修飾及加工，但未見(jiàn)三七及金銀花的多糖對(duì)比研究。本研究采用正交試驗(yàn)分別研究金銀花和三七塊根中多糖的提取，探討并對(duì)比其最佳提取工藝，進(jìn)而比較兩者粗多糖的含量差異，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

三七采自云南省文山州丘北縣二年三七，金銀花采自河南省鞏義市浮戲山山區(qū)。

1.2試劑和儀器設(shè)備

離心機(jī)(80-1)，數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(G2X-9070 MBE)，電子天平(AL240-1C)、恒溫光照培養(yǎng)箱(SPX-250B-G型)、754紫外分光光度計(jì)(上海菁華)，電熱恒溫水浴鍋(DK-S26)等。

乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，氯仿(天津化學(xué)試劑三廠(chǎng))，丙酮(天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng))，正丁醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)等，以上皆為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用多因素多水平正交設(shè)計(jì)(表1、2)，選取云南文山的三七根與河南鞏義的金銀花為原材料，提取樣品中多糖，探討其多糖提取的最佳工藝，并對(duì)比兩種樣品中多糖含量的差異，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。

表1 L934法提取金銀花多糖試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 L934提取三七多糖試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 試驗(yàn)方法

金銀花與三七根分別洗凈，粉碎，80℃烘干至恒重，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行高溫浸提，然后過(guò)濾并保存浸提液，過(guò)濾后濾渣再次浸提，合并提取液3500 r/min離心15 min，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2，按照設(shè)計(jì)的醇沉濃度4℃低溫醇沉24 h，3500 r/min離心15 min，Sevag法除去蛋白質(zhì)，至多糖溶液在250～280 nm處無(wú)紫外吸收峰為止。氯仿抽提，80%乙醇醇沉，丙酮洗滌，60～70℃烘箱干燥4 h，恒重后稱(chēng)量所得多糖。記錄并分析。

為研究浸提溫度對(duì)金銀花多糖提取的影響，本研究在其它條件相同的基礎(chǔ)上設(shè)置了溫度梯度40，50，60，70，80，90，100℃條件下探討多糖提取的差異。金銀花洗凈烘干，粉碎，稱(chēng)取2 g加入20倍蒸餾水分別置于不同的溫度條件下浸泡3 h，過(guò)濾并保存提取液。濾渣中加入20倍蒸餾水重復(fù)上述過(guò)程，共提取2次，合并提取液3500 r/min離心15 min，取上清液，氯仿萃取2次，70%乙醇醇沉。

根據(jù)此試驗(yàn)結(jié)果選擇三個(gè)溫度水平納入正交試驗(yàn)的一個(gè)因素，另選擇三個(gè)因素設(shè)計(jì)金銀花多糖提取正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

三七根洗凈，烘干，粉碎，分為9組每組稱(chēng)量2 g三七粉，無(wú)水乙醇浸泡除去色素，再次離心干燥，按照表2中的四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，90℃水浴浸提，離心取上清液，濃縮后分別加入相應(yīng)體積乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜，洗滌，離心棄上清，干燥后稱(chēng)重。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)金銀花多糖提取的影響

在其它試驗(yàn)條件完全相同，但采用不同浸提溫度提取金銀花多糖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度不同金銀花浸提液的色澤差別較大，浸提溫度越高，浸提液顏色越深，說(shuō)明金銀花中含有一定的色素，這些色素會(huì)隨著溫度的升高越容易被提取出來(lái)。此外，在醇沉?xí)r，觀(guān)察發(fā)現(xiàn)60℃醇沉?xí)r多糖質(zhì)地均勻細(xì)膩，但得量較低，每克金銀花提取多糖0.0245 g(見(jiàn)表3)，80℃條件下多糖得量有所提高，100℃時(shí)多糖得量最大，每克金銀花提取多糖0.0391 g，但多糖質(zhì)地較粗糙。但總體呈現(xiàn)浸提溫度越高，多糖提取量越大的趨勢(shì)。據(jù)此，在金銀花多糖提取的正交試驗(yàn)中，浸提溫度分別選擇三個(gè)有代表性的60℃，80℃，100℃。

表3 不同溫度條件下金銀花多糖提取率

2.2 正交試驗(yàn)提取金銀花多糖結(jié)果分析

試驗(yàn)9(A3B3C2D1)提取得到金銀花粗多糖量較多(見(jiàn)表4)，每克金銀花可提取粗多糖0.0305 g，試驗(yàn)4(A2B1C2D3)提取得到金銀花粗多糖量最少，每克金銀花提取粗多糖量?jī)H0.0180 g，且不同的試驗(yàn)組合多糖提取量有較大的差異。

表4 L9(34)法正交試驗(yàn)提取金銀花多糖的結(jié)果

計(jì)算相應(yīng)的K值并對(duì)比發(fā)現(xiàn)， 與KA2和KA3相比，KA1最大，說(shuō)明浸提時(shí)間3 h為最佳方案，浸提時(shí)間延長(zhǎng)反而多糖提取質(zhì)量降低；KB3則明顯高于KB1和KB2，表明溫度越高(100℃)提取效果越好；KC2高于KC1和KC3，但三者差距最小，故氯仿浸提次數(shù)對(duì)多糖提取影響程度相對(duì)于其它因素來(lái)說(shuō)最小，浸提兩次最佳；KD2高于KD1和KD3，說(shuō)明醇沉濃度70%最佳。

計(jì)算R值并對(duì)比發(fā)現(xiàn)，選擇的4個(gè)因素對(duì)金銀花多糖提取的影響力為B > D > A > C，即浸提溫度對(duì)金銀花多糖提取量影響最大，此結(jié)果與表2顯示的結(jié)果一致，隨著溫度上升，多糖得量也逐漸上升；其次是醇沉?xí)r乙醇濃度，乙醇濃度為70%時(shí)，金銀花多糖提取量最多；然后是浸提時(shí)間，浸提3 h時(shí)有較好的提取效果；氯仿萃取次數(shù)影響最小，次數(shù)增加對(duì)多糖提取量影響不大。因此，為縮短提取時(shí)間可選擇較低的萃取次數(shù)。

由試驗(yàn)結(jié)果可得最佳金銀花多糖提取試驗(yàn)組合為A1B3C2D2，即100℃熱水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉濃度70%。

2.3 正交試驗(yàn)提取三七多糖結(jié)果分析

由三七多糖提取結(jié)果分析可知，試驗(yàn)組合3(A1B3C3D3)提取得到的三七粉粗多糖量較多(見(jiàn)表5)，每克三七粉提取粗多糖0.1596 g，試驗(yàn)組合5和組合8分別為0.0224 g/g和0.0220 g/g；試驗(yàn)組合4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量?jī)H為0.0498 g，且不同的試驗(yàn)組合粗多糖提取量差異較大。

表5 L9(34)法正交試驗(yàn)提取三七多糖的結(jié)果

計(jì)算相應(yīng)的K值并對(duì)比發(fā)現(xiàn)，KA1> KA3> KA2，KA1最大，說(shuō)明最佳料液比是1:20；KB3> KB2> KB1，表明浸提次數(shù)的增加能顯著增加三七粗多糖提取量；KC3> KC1> KC2，說(shuō)明浸提時(shí)間3h有較好的提取效果；KD3> KD1> KD2，說(shuō)明醇沉濃度80%最佳。

計(jì)算R值并對(duì)比發(fā)現(xiàn)，選擇的4個(gè)因素對(duì)三七多糖提取的影響力為D > C > B > A，即醇沉濃度對(duì)三七多糖提取量影響最大；其次是浸提時(shí)間及浸提次數(shù)；最后是料液比。

因此，三七多糖最佳提取試驗(yàn)組合為A1B3C3D3，即料液比1:20條件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉濃度80%可得到最多的多糖提取量。

2.4 三七與金銀花多糖提取量比較

分析金銀花與三七正交試驗(yàn)的9個(gè)試驗(yàn)組合，我們發(fā)現(xiàn)金銀花多糖提取的試驗(yàn)組合9(A3B3C2D1)中每克金銀花可提取粗多糖0.0305 g，三七多糖提取試驗(yàn)4(A2B1C2D3)中每克三七提取粗多糖0.1596 g，表明云南文山三七粗多糖的提取量明顯高于河南鞏義的金銀花多糖提取量；金銀花提取試驗(yàn)4(A2B1C2D3)提取得到的金銀花粗多糖量最少，每克金銀花提取到粗多糖量?jī)H為0.0180 g，而三七多糖提取試驗(yàn)4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量為0.0498 g，即云南文山的三七粗多糖的提取量依舊明顯高于河南鞏義的金銀花多糖提取量。因此，云南文山的三七粗多糖含量應(yīng)高于河南鞏義的金銀花粗多糖含量。

3 結(jié)論

對(duì)于植物多糖的研究，國(guó)內(nèi)外對(duì)三七多糖的研究相比較其它藥用植物來(lái)說(shuō)相對(duì)較少[11]，更鮮少研究不同藥用植物之間多糖提取及其對(duì)比分析。藥用植物多糖的研究必將進(jìn)一步指導(dǎo)多糖在臨床方面的應(yīng)用，為人類(lèi)造福。金銀花多糖提取試驗(yàn)中影響因素較大的是浸提溫度，其次是醇沉?xí)r乙醇的濃度，然后是浸提時(shí)間，氯仿萃取次數(shù)影響最小。金銀花多糖提取的最佳試驗(yàn)方案為A1B3C2D2，即100℃熱水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉濃度70%，可得到較多的粗多糖提取量。提取三七多糖時(shí)影響較大的因素是醇沉濃度，其次是浸提時(shí)間及浸提次數(shù)，最后是料液比。三七多糖提取的最佳方案為A1B3C3D3，即料液比1∶20條件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉濃度80%可得到最多的多糖提取量。云南文山三七根中多糖含量高于河南鞏義金銀花中多糖含量。