高金偉 張文慧 竇 勇 姜智飛, 賈旭穎 邵 蓬 周文禮

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300350; 2. 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室，天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384; 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)，天津 300221)

纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)屬于裸藻門、裸藻屬, 主要分布在陽光充足、有機(jī)質(zhì)豐富、靜止無流水的小水體中[1], 在營養(yǎng)充足、天然原生態(tài)的環(huán)境中得以繁殖[2]。其營養(yǎng)方式為兼性營養(yǎng)[3], 既可以通過光合作用制造營養(yǎng), 有效固定環(huán)境中的CO[4],2

又可以通過滲透營養(yǎng)來攝取有機(jī)物, 如牛肉膏、蛋白胨、醋酸鹽、乙醇等[5—8], 不同的營養(yǎng)方式對微藻代謝產(chǎn)物的種類與含量有較大的影響[9,10]。

纖細(xì)裸藻含有豐富的營養(yǎng)成分, 包括氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、裸藻糖和抗氧化成分(如β胡蘿卜素、維生素C、維生素E等), 富含59種人體必需的營養(yǎng)元素, 氨基酸種類尤其豐富, 含有人類所需的全部氨基酸。目前, 纖細(xì)裸藻在生物餌料應(yīng)用方面的重要性逐漸被認(rèn)識, 已被增補(bǔ)到《飼料原料目錄》中。但是, 對纖細(xì)裸藻代謝產(chǎn)物與環(huán)境互作機(jī)制這一問題的研究尚未見報道。

本文在此基礎(chǔ)上, 選取自養(yǎng)、異養(yǎng)、兼養(yǎng)、光誘導(dǎo)四種培養(yǎng)方式, 實(shí)驗室條件下研究了培養(yǎng)方式對纖細(xì)裸藻生長、脂肪酸、氨基酸的影響, 并探討了可能的作用機(jī)理, 為闡明纖細(xì)裸藻對不同培養(yǎng)方式的響應(yīng)提供科學(xué)依據(jù), 同時為其開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 微藻

纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)由天津農(nóng)學(xué)院漁業(yè)資源與環(huán)境實(shí)驗室提供。

1.2 培養(yǎng)方法

自養(yǎng)培養(yǎng)纖細(xì)裸藻的光自養(yǎng)實(shí)驗在三角瓶中進(jìn)行, 使用本實(shí)驗室配制的AF-6自養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為(25±1)℃, 光照30 μmol/(m2·s),光暗比12 L∶12 D。每天搖瓶數(shù)次, 防止微藻細(xì)胞附壁或下沉。連續(xù)培養(yǎng), 每5天擴(kuò)培一次, 培養(yǎng)完成后進(jìn)行濃縮干燥, 得到藻粉待用。

兼養(yǎng)培養(yǎng)纖細(xì)裸藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)驗在三角瓶中進(jìn)行, 使用本實(shí)驗室配制的HUT異養(yǎng)培養(yǎng)基(KH2PO4: 0.02 g/L; MgSO4·7H2O: 0.025 g/L; 酵母抽提液: 0.4 g/L; 乙酸鈉: 0.4 g/L; 蛋白胨: 0.6 g/L)進(jìn)行培養(yǎng), 其他條件同自養(yǎng)培養(yǎng)。

異養(yǎng)培養(yǎng)將纖細(xì)裸藻在0.8%的瓊脂培養(yǎng)皿中劃線, 置于黑暗環(huán)境中篩選, 選擇在黑暗條件下生長狀況良好的裸藻細(xì)胞, 挑取并接入三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng), 光照為0, 其他條件同上。

異養(yǎng)培養(yǎng)+光誘導(dǎo)(簡稱光誘導(dǎo))在黑暗條件下纖細(xì)裸藻異養(yǎng)培養(yǎng)方法同上, 培養(yǎng)96h后, 將其轉(zhuǎn)入光照條件下光誘導(dǎo)48h, 溫度控制在25℃左右,連續(xù)光照30 μmol/(m2·s) 48h, 培養(yǎng)完成后進(jìn)行濃縮干燥, 得到藻粉待用。

1.3 實(shí)驗方法

細(xì)胞密度與比生長速率μ的測定使用血球計數(shù)板測定藻細(xì)胞密度。

根據(jù)公式計算比生長速率μ[11]。

式中,X2為第二次取樣時(t2)的細(xì)胞密度;X1為第一次取樣時(t1)的細(xì)胞密度

細(xì)胞干重的測定取10 mL藻液, 分別稀釋8個梯度后測藻細(xì)胞密度, 然后將樣品置于烘箱中,105℃下烘干, 干燥后使用電子天平測定藻細(xì)胞干重,作細(xì)胞密度-干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1), 計算藻細(xì)胞干重[12]。

圖1 藻細(xì)胞干重與密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Curves of the relation between algal cell dry weight and cell density

脂肪酸組成分析甲脂化方法: 取樣品加入到15 mL離心管中, 加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液, 水浴回流至油滴消失。加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液, 繼續(xù)煮沸30min。加入適量異辛烷溶液, 移去冷凝管, 加入20 mL飽和氯化鈉溶液。吸取上層溶液1—2 mL, 加入無水硫酸鈉脫水, 進(jìn)樣。

使用Agilent 7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析, 所使用的色譜柱型號為CNW CD-2560, 規(guī)格為100 m×0.25 mm×0.20 μm。運(yùn)行參數(shù)為: 進(jìn)樣口溫度為250℃, 檢測器類型為FID, 檢測溫度為260℃,進(jìn)樣量為1 μL, 分流比為10∶1, 載氣流速為0.5 mL/min。柱溫箱升溫程序如下: 溫度達(dá)到130℃后, 保持5min, 然后以4℃/min的速率升溫至240℃, 保持30min。

氨基酸含量測定取0.5 g藻粉于20 mL水解管中, 加入6 mol/L的鹽酸溶液16 mL, 真空脫氣30min, 充氮封管; 在110℃下水解22—24h后, 用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容; 取1 mL水解液于小瓶中, 真空脫酸抽干; 連續(xù)兩次加入1 mL蒸餾水后抽干, 備用; 加入0.02 mol/L鹽酸溶液1 mL,充分溶解后, 取500 μL置于5 mL的離心管中, 分別加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL, 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL混勻; 室溫放置1h后, 加入正己烷, 劇烈搖動, 放置10min; 取下層溶液, 用0.22 μm的水相濾膜過濾, 上機(jī)分析。

使用Agilent 1260液相色譜儀進(jìn)行分析, 流動相A為乙腈(0.1 mol/L), 3%乙酸鈉溶液, pH為6.5。流動相B為80%乙腈水溶液。所使用的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠, 規(guī)格為4.6×250 mm×5 μm。運(yùn)行參數(shù)為: 柱溫為40 ℃, 流速為1.0 mL/min, 檢測波長為254 nm, 洗脫梯度如表1所示。

表1 洗脫梯度Tab. 1 Elution gradient

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003整理數(shù)據(jù), 使用SigmaPlot10.0及Excel 2003繪制圖形, SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 設(shè)定顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 四種培養(yǎng)方式對纖細(xì)裸藻細(xì)胞密度的影響

如圖2所示, 在0—48h四種培養(yǎng)方式下藻細(xì)胞均呈對數(shù)生長, 自養(yǎng)組纖細(xì)裸藻生長速度顯著低于其他三組(P＜0.05), 光誘導(dǎo)組與兼養(yǎng)組藻細(xì)胞生長最快, 明顯高于其他兩組(P＜0.05)。48h后, 異養(yǎng)組藻細(xì)胞密度開始下降, 顯著低于其他實(shí)驗組(P＜0.05)。生長至168h, 兼養(yǎng)條件下藻細(xì)胞密度、細(xì)胞干重和平均比生長率(表2)顯著高于其他組(P＜0.05), 密度達(dá)到1.27×106cells/mL, 細(xì)胞干重高達(dá)0.044 g/L; 自養(yǎng)組與光誘導(dǎo)組細(xì)胞密度、比生長速率均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 四種方式培養(yǎng)纖細(xì)裸藻細(xì)胞密度的變化Fig. 2 Effects of four culture methods on the cell density ofEuglena gracilis

表2 四種方式下纖細(xì)裸藻干重和細(xì)胞比生長速率結(jié)果對比Tab. 2 Dry weight and specific growth rate of Euglena gracilis grown by four culture methods

2.2 四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻脂肪酸含量變化

表3列出了纖細(xì)裸藻在四種培養(yǎng)方式下脂肪酸種類, 自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組纖細(xì)裸藻脂肪酸碳鏈組成均在C12—C22, 主要為油酸甲酯(C18∶1N9C)、反式亞油酸(C18∶2N6T)和α-亞油酸(C18∶3N3)等。其中,自養(yǎng)組纖細(xì)裸藻共含有21種脂肪酸, 其中飽和脂肪酸(SFA)7種, 主要為月桂酸(C12∶0)、銀杏酸(C13∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、十五碳酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)和硬脂酸(C18∶0), 單不飽和脂肪酸(MUFA) 4種, 多不飽和脂肪酸(PUFA)10種。

兼養(yǎng)條件下共有19種脂肪酸, 飽和脂肪酸5種,主要為月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)和十八烷酸(C18∶0), 與自養(yǎng)組相比, 減少了銀杏酸(C13∶0)和十七烷酸(C17∶0)兩種, 單不飽和脂肪酸5種, 增加了反式油酸(C18∶1n9t); PUFA9種, 減少了二十二碳二烯酸(C22∶2n6)。

表3 在四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻脂肪酸種類Tab. 3 The kinds of fatty acids in E. gracilis grown by four culture methods

異養(yǎng)組與光誘導(dǎo)組纖細(xì)裸藻脂肪酸碳鏈組成均在C8—C22之間, 與自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組相比, SFA增加了3種, 分別為辛酸(C8∶0)、月桂酸(C10∶0)和十一烷酸(C11∶0)。異養(yǎng)組共含有29種脂肪酸組分,主要為肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1N9C)、花生四烯酸(C20∶4N6)和二十碳五烯酸EPA(C20∶5N3)等, 占總含量的58%以上, 其中SFA12種, MUFA8種, PUFA9種。光誘導(dǎo)組共含有28種組分, 主要為棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1N9C)、亞油酸(C18∶2N6C)和α-亞油酸(C18∶3N3), 占總脂肪酸含量的60%以上, 其中SFA12種, MUFA6種,PUFA10種。

雖然四種培養(yǎng)方式下脂肪酸碳鏈組成相似, 但是脂肪酸含量與所占比例變化十分明顯。由表4和圖3可知, 脂肪酸組分含量由高到低依次為光誘導(dǎo)組、異養(yǎng)組、兼養(yǎng)組、自養(yǎng)組。在異養(yǎng)組中, 飽和脂肪酸占比例最高, 為49.29%, 其他三個實(shí)驗組均為多不飽和脂肪酸占比最高, 其自養(yǎng)組、兼養(yǎng)組和光誘導(dǎo)組占比分別為65.90%、68.08%和54.83%。

2.3 四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻氨基酸含量變化

氨基酸自動分析儀對17種游離氨基酸進(jìn)行檢測, 檢測結(jié)果如表5所示, 氨基酸種類略有差別, 在自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組檢測出了半胱氨酸(Cysteine), 而在異養(yǎng)組和光誘導(dǎo)組未檢測出, 而在異養(yǎng)組和光誘導(dǎo)組檢測出了胱氨酸(Cystine), 在自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組未檢出。游離氨基酸含量由高到低依次為: 光誘導(dǎo)組＞兼養(yǎng)組＞異養(yǎng)組＞自養(yǎng)組, 其中, 自養(yǎng)組主要為亮氨酸(LEU)、谷氨酸(GLU)和精氨酸(ARG), 占總量的39%; 異養(yǎng)組主要為谷氨酸(GLU)、精氨酸(ARG)和脯氨酸(PRO), 占34.7%; 異養(yǎng)組主要為亮氨酸(LEU)和谷氨酸(GLU), 占30.6%, 光誘導(dǎo)組主要為亮氨酸(LEU)、精氨酸(ARG)和脯氨酸(PRO), 占總量的30.5%。

四個實(shí)驗組中均檢測到7種必需氨基酸(EAA)：甲硫氨酸(MET)、纈氨酸(VAL)、異亮氨酸(ILE)、苯丙氨酸(PHE)、亮氨酸(LEU)、蘇氨酸(THR)和賴氨酸(LYS), 四個實(shí)驗組必需氨基酸含量由高到低為兼養(yǎng)組＞光誘導(dǎo)組＞異養(yǎng)組＞自養(yǎng)組, 含量分別為134.37、128.86、100.97和85.84 mg/g。實(shí)驗組EAA/TAA值均超過30%, 兼養(yǎng)組＞自養(yǎng)組＞光誘導(dǎo)組＞異養(yǎng)組, 占比分別為37.52%、37.15%、33.77%和30.58%, EAA/NEAA分別為0.6、0.59、0.51和0.44。

表4 四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻脂肪酸含量Tab. 4 Grouping of E. gracilis grown by four culture methods based on fatty acids

3 討論

3.1 培養(yǎng)方式對藻細(xì)胞生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn), 纖細(xì)裸藻在異養(yǎng)培養(yǎng)后期, 細(xì)胞密度下降, 比生長速率僅為0.049/d, 李姿等[13]的研究中發(fā)現(xiàn), 鈍頂螺旋藻異養(yǎng)培養(yǎng)后期藻密度也存在下降趨勢, 汪晶等[14]發(fā)現(xiàn), 混養(yǎng)培養(yǎng)Syuechococcussp.時, 有機(jī)碳的存在會促進(jìn)無機(jī)碳的利用。在異養(yǎng)條件下纖細(xì)裸藻細(xì)胞密度下降可能是因為沒有足夠的無機(jī)碳源滿足其生長的需要, 也可能與共生菌在異養(yǎng)條件下占優(yōu)勢有關(guān)。

在實(shí)驗后期兼養(yǎng)條件下纖細(xì)裸藻生長最佳,說明兼養(yǎng)條件下纖細(xì)裸藻更能有效地積累生物量,李昌靈等的研究[15,16]表明, 兼養(yǎng)條件下培養(yǎng)小球藻與鈍頂螺旋藻也有同樣的規(guī)律, 在光暗條件轉(zhuǎn)換過程中, 纖細(xì)裸藻代謝方式可以快速由自養(yǎng)切換到異養(yǎng)[17]。

圖3 四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻脂肪酸組分百分比疊加圖Fig. 3 Grouping of E. gracilis grown by four culture methods based on fatty acid percentages

3.2 培養(yǎng)方式對脂肪酸的影響

脂肪酸是指一端含有一個羧基的長的脂肪族碳?xì)滏? 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)學(xué)價值。陸嘉欣[18]研究中顯示, 纖細(xì)裸藻(4d)碳鏈組成在C11—C22,飽和脂肪酸7種, 占比最高的為飽和脂肪酸。而在本研究中, 自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組碳鏈組成在C12—C22,異養(yǎng)組和光誘導(dǎo)組在C8—C22, SFA種類增多, 均有12種。在本研究中, 除異養(yǎng)組占比最高的是SFA,其余三個實(shí)驗組占比最高的為PUFA, 其結(jié)果不一致的原因一方面可能是因為本實(shí)驗中纖細(xì)裸藻未經(jīng)過誘變, 另一方面可能是因為培養(yǎng)基的不同導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的差異。

3.3 培養(yǎng)方式對氨基酸的影響

在四種培養(yǎng)方式下, 纖細(xì)裸藻均含有17種氨基酸, 其中必需氨基酸占總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于30.5%。氨基酸含量兼養(yǎng)條件下最高, 比生長速率在此條件下也最高, 為0.214/d。在自養(yǎng)和兼養(yǎng)條件下纖細(xì)裸藻所有氨基酸種類相同, 異養(yǎng)和光誘導(dǎo)條件下氨基酸種類相同, 可能的原因為不同培養(yǎng)方式下碳利用方式和途徑不同導(dǎo)致纖細(xì)裸藻一些氨基酸代謝產(chǎn)生差異。

有學(xué)者曾測定石莼(Ulva lactucaL.)、麒麟藻(Eucheuma serra)、馬尾藻(Scagassum)、羊棲藻(Sargassum fusiforme)、海帶(Saccharina japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、紫菜(porphyra)、滸苔(Euteromorpha)和龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)氨基酸的含量[19], 研究顯示, 紫菜氨基酸的總含量最高, 為30.92 g/100 g, 除谷氨酸(Glu)外, 其他游離氨基酸含量均高于其他幾種藻類。而在本實(shí)驗中,四種培養(yǎng)方式下的纖細(xì)裸藻氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫菜含量, 自養(yǎng)組氨基酸含量最低, 達(dá)231.1 g/100 g,是紫菜氨基酸含量的7.47倍, 最高的光誘導(dǎo)組含量達(dá)到381.57 g/100 g, 是紫菜氨基酸含量的12.34倍。人體必需氨基酸的含量同樣遠(yuǎn)高于紫菜, 是紫菜的7.50—11.74倍。

表5 四種培養(yǎng)方式下纖細(xì)裸藻氨基酸含量Tab. 5 Amino acid contents in E. gracilis grown by four culture methods

兼養(yǎng)組、自養(yǎng)組、光誘導(dǎo)組和異養(yǎng)組EAA/TAA值分別為37.52%、37.15%、33.77%和30.58%,EAA/NEAA分別為0.6、0.59、0.51和0.44, 除了兼養(yǎng)組, 其他組必需氨基酸含量與E/N值均略低于FAO/WHO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必需氨基酸含量40%左右和E/N值0.6[20], 這是由于實(shí)驗過程中未檢測色氨酸(Try)。有研究顯示[21],蛋白核小球藻和橢圓小球藻的EAA/TAA值分別為38.05%和40.28%, E/N值分別為0.61和0.67, 本實(shí)驗中纖細(xì)裸藻兼養(yǎng)組和自養(yǎng)組EAA/TAA值和EAA/NEAA值略低于小球藻。董黎明等研究顯示, 異養(yǎng)培養(yǎng)的橢圓小球藻氨基酸組成品質(zhì)更高[22], 本實(shí)驗中結(jié)果相反, 異養(yǎng)組纖細(xì)裸藻氨基酸品質(zhì)比自養(yǎng)組和兼養(yǎng)組都低。

4 結(jié)論

光誘導(dǎo)培養(yǎng)可顯著提高纖細(xì)裸藻總脂肪酸、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量; 異養(yǎng)培養(yǎng)可顯著提高纖細(xì)裸藻飽和脂肪酸含量; 兼養(yǎng)培養(yǎng)可顯著提高纖細(xì)裸藻必需氨基酸含量。