徐小艷 ，王建君，馮智坤，門(mén)穎麗，王慧，楊金花

XU Xiaoyan1,WANG Jianjun1,FENG Zhikun1,MEN Yingli2,WANG Hui2,YANG Jinhua1

1.Department of Pathology,People’s Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450000,China;2.Academy of Sciences Expert Workstation,People's Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450000,China

0 引言

目前，乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的健康。在乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition,EMT）是其中一個(gè)核心的生物學(xué)進(jìn)程，與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。JMJD3又稱(chēng)賴(lài)氨酸去甲基化酶6B（lysine demethylase 6B,KDM6B）作為一種Lys27位點(diǎn)三甲基化組蛋白H3（histone H3 methylated Lys27，H3K27me3）去甲基化酶[1]，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。JMJD3在腫瘤中是促癌基因還是抑癌基因研究報(bào)道尚不一致，有關(guān)JMJD3在乳腺癌中的作用，以及JMJD3與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性尚未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。本研究收集120例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)JMJD3和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)，并分析其相關(guān)性及臨床病理意義，以拓展和豐富人們對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集鄭州人民醫(yī)院2014年1月—2015年12月間收治的120例乳腺原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及相應(yīng)的癌旁病理活檢標(biāo)本和相關(guān)臨床資料?；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療。按照2012年WHO乳腺癌組織病理分級(jí)分類(lèi)法對(duì)其進(jìn)行分組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，并經(jīng)鄭州人民醫(yī)院病理科確診。

1.2 主要試劑

JMJD3一抗兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，E-cadherin、Vimentin和N-cadherin一抗兔抗人單克隆抗體（即用型）、二抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均為福州邁新公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

主要步驟如下：（1）石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；（2）EDTA抗原修復(fù)；（3）兔抗人單克隆抗體一抗37℃孵育2 h；（4）二抗37℃孵育20～30 min；（5）DAB顯色5～10 min；（6）脫水、透明和封片。用已知JMJD3、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin陽(yáng)性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽(yáng)性和空白對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

JMJD3陽(yáng)性信號(hào)呈棕褐色，表達(dá)于細(xì)胞核；E-cadherin和N-cadherin陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞膜；Vimentin陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。按樣本中JMJD3、E-cadherin、Vimentin及N-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分為4個(gè)等級(jí)[4]：＜5%為陰性、5%～＜25%為弱陽(yáng)性、25%～50%為中等陽(yáng)性、≥50%為強(qiáng)陽(yáng)性。其中陰性和弱陽(yáng)性判斷為低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性判斷為高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率=（中等陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性樣本量）/總樣本量，免疫組織化學(xué)的判讀由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，JMJD3、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率和病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，蛋白間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中JMJD3、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)

JMJD3主要定位于細(xì)胞核，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織中呈棕褐色，在導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.326,P=0.007），見(jiàn)圖1、表1。JMJD3表達(dá)較高者，組織學(xué)分化程度高，細(xì)胞黏附性強(qiáng)，極性較好，JMJD3表達(dá)較低者，組織學(xué)分化程度差，細(xì)胞黏附性下降，失去極性，細(xì)胞梭形更為明顯，見(jiàn)圖2。

E-cadherin在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織中主要定位于細(xì)胞膜，為粗細(xì)相對(duì)均勻的棕褐色顆粒，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.256,P=0.001）。Vimentin主要表達(dá)于上皮周?chē)拈g質(zhì)細(xì)胞中，在癌及癌旁組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，為粗細(xì)不等的棕褐色顆粒，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.033,P=0.000）。N-cadherin在癌及癌旁組織中主要定位于細(xì)胞膜，為粗細(xì)相對(duì)均勻的棕褐色顆粒，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.281,P=0.000），見(jiàn)圖1、表1。

2.2 JMJD3、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系

在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，JMJD3與腫瘤直徑（χ2=9.697,P=0.008）、組織學(xué)分級(jí)（χ2=27.313,P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=12.587,P=0.000）TNM分期有關(guān)（χ2=12.385,P=0.000），與乳腺癌患者年齡和腫瘤位置均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。E-c a d h e r i n 在高分化、中分化和低分化乳腺癌中表達(dá)率依次降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.152,P=0.001）；其在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組中低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.903,P=0.002）；其在TNM Ⅲ期、Ⅳ期組別低于Ⅰ期、Ⅱ期組別，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.771,P=0.000）。E-cadherin與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑均無(wú)關(guān)（均P＞0.05)。Vimentin在高分化、中分化和低分化乳腺癌中表達(dá)率依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.410,P=0.000）；其在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組中高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=14.090,P=0.000），TNMⅢ期、Ⅳ期組高于Ⅰ期、Ⅱ期組（χ2=13.218,P=0.000），與年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。N-cadherin在高分化、中分化和低分化中表達(dá)率依次升高（χ2=28.410,P=0.000）；其在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組中高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=17.678,P=0.000），在TNM Ⅲ期、Ⅳ期組高于Ⅰ期、Ⅱ期組（χ2=30.035,P=0.000）。N-cadherin與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置及腫瘤直徑均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 乳腺癌和癌旁組織中JMJD3、E-cadherin、Vimentin及N-cadherin的陽(yáng)性表達(dá) (n(%))Table 1 Expression of JMJD3,E-cadherin,Vimentin and N-cadherin in breast cancer tissues and adjacent tissues (n(%))

圖2 乳腺癌JMJD3表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 (HE ×200)Figure 2 Effects of JMJD3 expression on morphology of breast cancer cells (HE ×200)

2.3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中JMJD3與E-cadherin、Vimentin和N-cadherin相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示JMJD3和E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.204,P=0.025）。JMJD3和Vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.467,P=0.000）。JMJD3和N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.500,P=0.000），見(jiàn)表3。

3 討論

JMJD3編碼基因位于人類(lèi)第17號(hào)染色體上，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Tokunaga等[5]對(duì)151例結(jié)腸癌患者的術(shù)后生存分析結(jié)果表明，JMJD3低表達(dá)者術(shù)后生存期普遍較短，且回歸分析表明JMJD3的低表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)JMJD3過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[6]。胡賀芳等[7]研究發(fā)現(xiàn)JMJD3表達(dá)降低可能促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展。李彥偉等[8]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JMJD3較瘤旁組織表達(dá)降低，其過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力，該機(jī)制通過(guò)影響SNAIL基因調(diào)控區(qū)H3K27me3水平而調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤侵襲過(guò)程[9]。

JMJD3是促癌基因還是抑癌基因研究報(bào)道尚不一致，本研究采用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)JMJD3在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織表達(dá)率較癌旁組織低，其在組織學(xué)分化差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較高TNM分期的組織中表達(dá)率減低，提示JMJD3在乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中扮演了抑癌基因的角色。此外本研究結(jié)果還顯示JMJD3低表達(dá)與腫瘤直徑相關(guān)，腫瘤直徑的大小反映細(xì)胞增殖能力，我們推測(cè)JMJD3對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，這與以往其在胃癌研究報(bào)道觀點(diǎn)一致[6]。

表2 乳腺癌中JMJD3、E-cadherin、Vimentin及N-cadherin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 (n(%))Table 2 Correlation of JMJD3,E-cadherin,Vimentin and N-cadherin expression with clinicopathological characteristics of breast cancer patients (n(%))

表3 乳腺癌中JMJD3與E-cadherin,Vimentin和N-cadherin的Spearman相關(guān)性分析Table 3 Spearman correlation analysis of JMJD3 expression with E-cadherin,Vimentin and N-cadherin expression in breast cancer tissues

在乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制中，EMT是其中一個(gè)核心的生物學(xué)進(jìn)程。EMT的過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白 E-cadherin 減少，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Vimentin和N-cadherin表達(dá)量上升[10-12]。E-cadherin主要分布于胚胎組織和成熟組織的上皮細(xì)胞中，除具有調(diào)節(jié)胚胎組織的發(fā)育、組織形成、參與細(xì)胞與細(xì)胞間信息傳遞交流等作用外，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的黏附聚集、維持上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性、極性和參與分化調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。Vimentin主要表達(dá)于間葉組織和淋巴造血細(xì)胞，在上皮中幾乎不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)可有表達(dá)。N-cadherin表達(dá)于神經(jīng)外胚層和中胚層來(lái)源的組織，正常上皮組織不表達(dá)或低表達(dá)。N-cadherin在上皮組織中的異位表達(dá)可以影響上皮細(xì)胞的形態(tài)和行為，誘導(dǎo)其向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，即產(chǎn)生EMT。

本研究結(jié)果顯示從乳腺癌旁組織到乳腺癌組織JMJD3和E-cadherin陽(yáng)性率逐漸減少，而Vimentin和N-cadherin陽(yáng)性率逐漸增高；同時(shí)它們均與乳腺癌分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明JMJD3和EMT相關(guān)蛋白共同參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其可能機(jī)制是通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞間的黏附力，使乳腺癌更容易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)情況與以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致[13-14]。

通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)JMJD3表達(dá)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響在膠質(zhì)瘤細(xì)胞[15]、肝癌細(xì)胞[16-17]、腎癌細(xì)胞[18]和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[19]已有研究報(bào)道，其在乳腺癌中尚未見(jiàn)研究報(bào)道。上述研究均表明JMJD3過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。本研究相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)JMJD3與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)，與Vimentin和N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明JMJD3低表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)E-cadherin及上調(diào)Vimentin和N-cadherin的表達(dá)使乳腺癌上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。提示JMJD3陽(yáng)性率較低的乳腺癌患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的組織學(xué)分化，而組織學(xué)分化較差的乳腺癌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上細(xì)胞極性消失，細(xì)胞梭形明顯，黏附性下降，從形態(tài)學(xué)上表明JMJD3可能通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究從蛋白水平對(duì)乳腺癌中JMJD3、E-cadherin和Vimentin表達(dá)進(jìn)行分析，尚缺少分子生物學(xué)調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中組蛋白去甲基化酶JMJD3與E-cadherin呈正相關(guān)，與Vimentin和N-cadherin呈負(fù)相關(guān)，JMJD3可能通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)控乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。