孫勝楠，楊春，李鐵軍，張秀娟，張曉彤，胡博，張琦，郭佳，彭英華※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.東豐縣梅花鹿產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，吉林 長春 136300；3.東豐縣梅花鹿科技服務(wù)中心，吉林 長春 136300）

水貂犬瘟熱（canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-2]。發(fā)病初期表現(xiàn)為感冒癥狀，兩眼有淚，鼻孔有少量分泌物，臨床癥狀包括嘔吐、發(fā)熱、精神不振、腹瀉、腳墊增厚、流涎、甚至死亡。斷奶前后的幼貂和育成貂對犬瘟熱病毒較為易感，成年貂死亡率為30%～50%，幼年貂死亡率高達(dá)80%～90%，是目前危害我國養(yǎng)貂業(yè)的重大疫病之一[2-3]。犬瘟熱于1809 年首次被報道，我國黑龍江省于1973 年首次報道了水貂犬瘟熱的流行，隨后逐漸蔓延至全國[3]。該病經(jīng)常引起混合感染和繼發(fā)感染，具有“毀滅性傳染病”之稱，目前水貂犬瘟熱在臨床上沒有特效的治療藥物，只能通過疫苗接種進(jìn)行免疫預(yù)防，然而由于免疫效果不好等原因，造成免疫失敗，不僅給養(yǎng)殖場帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且也給從事毛皮動物飼養(yǎng)、繁殖和疫病防治的工作者帶來很大的難題。因此，對其致病機(jī)理、檢測方法及預(yù)防治療手段進(jìn)行研究尤為重要。

1 病原學(xué)

犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）屬于副黏病毒科，與麻疹病毒（measles virus，MV）、牛瘟病毒（rinderpest virus）、小反芻獸疫病毒（pestedes petits ruminants pestivirus，PPRV）、海豹瘟熱病毒（phocine distemper virus，PDV）、海豚瘟熱病毒（dolphin distemper virus，DDV）、鼠海豚瘟熱病毒（porpoise morbilli virus，PMV）同屬于麻疹病毒屬成員[4]。CDV 與MV和RPV 在病毒結(jié)構(gòu)和超微形態(tài)上幾乎完全相同，親緣關(guān)系較近，分子生物學(xué)特征和抗原關(guān)系十分相似。CDV病毒基因組全長為15 690 bp，分子量為6 106kD，不分節(jié)、是非重疊的單股負(fù)鏈RNA 病毒。CDV 病毒粒子形狀多樣，多呈圓形或不規(guī)則狀，有時呈長絲狀，直徑120～300 nm，粒子中心含有直徑15～19 nm、螺旋形的核衣殼，核衣殼的成分為N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白，并且P 蛋白和L 蛋白具有聚合酶活性[5]。病毒粒子外面為雙層囊膜，內(nèi)部為M 蛋白，起著連接病毒囊膜和核衣殼的作用，囊膜上排列著1.3 nm 的由H 和F兩種糖蛋白組成的桿狀纖突，兩種蛋白在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中起一定的作用，二者缺一不可，H蛋白發(fā)揮細(xì)胞趨向作用，而F蛋白在融合過程中必不可少[6-7]。

CDV 能夠在來源于人、犬、貂、猴、雞的多種原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞系上生長繁殖，不同種類細(xì)胞繁殖的毒株會有差異，初次培養(yǎng)較為困難，一旦適應(yīng)某種細(xì)胞后在其他細(xì)胞上也較易生長。CDV 對犬肺巨噬細(xì)胞較為敏感，且分離成功率較高，可形成葡萄樣狀CPE（細(xì)胞病變效應(yīng)，cytopathic effect）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染CDV后能夠使雪貂、乳鼠和犬等發(fā)病，其中以雪貂最為敏感，通過連續(xù)接種能夠增強(qiáng)雪貂的致病力，目前雪貂為公認(rèn)的CDV 實(shí)驗(yàn)動物[8-9]。

CDV 具有病毒的一般特點(diǎn)，適存于偏低溫度（負(fù)溫度值以下），避光環(huán)境下生存期能夠無限延長，對于高溫、光照（日光、紫外線）和干燥的環(huán)境抵抗力不強(qiáng)，對酒精、乙醚、甲醛和煤酚皂等有機(jī)試劑較為敏感；最適pH 為7.0，在pH 4.5 以下和9.0 以上的酸堿環(huán)境下可使其迅速滅活；在2～4 ℃環(huán)境下可存活數(shù)周，室溫存活數(shù)天，50～60℃下30 min 就可使其迅速滅活，-70 ℃下可存活數(shù)年，凍干可長期保存。養(yǎng)殖場內(nèi)外環(huán)境常用的消毒劑為3%福爾馬林、5%石碳酸和3%氫氧化鈉等溶液，這些均對病毒具有較理想的殺滅效果[10]。

2 流行病學(xué)

水貂犬瘟熱的發(fā)生沒有明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)病，夏秋季為多發(fā)季節(jié)。不同年齡、品種的水貂對犬瘟熱病毒均易感染，發(fā)病的輕重程度取決于動物的飼養(yǎng)管理水平、自身抵抗力、病原體的數(shù)量和毒力以及養(yǎng)殖場的防疫措施等因素。2010～2012 年，王聰?shù)萚2]相繼檢測了山東省諸城、文登、臨沂與萊州等地貂場送診的996 例患病水貂，經(jīng)CDV 快速檢測試劑條與RT-PCR方法確診為犬瘟熱病毒感染的水貂病例有223 例，陽性率為22.39%，其中犬瘟熱單獨(dú)感染為87 例。發(fā)病水貂年齡最小的是1 月齡幼貂，3～4 月齡水貂發(fā)病率最高，發(fā)病季節(jié)多在7～8 月。2016 年，張海英等[11]對2011～2013 年河北省樂亭縣動物疫病預(yù)防控制中心化驗(yàn)室及所屬基層站化驗(yàn)室共接診的1 065 個臨床病例進(jìn)行回顧性分析，通過CDV 快速檢測試劑盒以及包涵體檢查發(fā)現(xiàn)上述的1 065 個病例中，確診為水貂犬瘟熱的病例165例，發(fā)病率為15.49%，病死率為68.48%。1～2月齡水貂發(fā)病率為8.25%，成年水貂發(fā)病率為11.02%，3月齡水貂發(fā)病率最高（20.38%）。2014年，山東榮成某水貂場暴發(fā)犬瘟熱，發(fā)病率為70%，死亡率高達(dá)50%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。2020 年，劉彩虹等[13]對2018 年7 月采集的山東某水貂養(yǎng)殖場發(fā)病水貂進(jìn)行犬瘟熱病毒分離鑒定及其H 基因序列分析，通過RT-PCR 方法鑒定為陽性，并將陽性病料接種Vero/Dog SLAM細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，得到4 株犬瘟熱病毒；H基因測序結(jié)果表明，水貂養(yǎng)殖場存在多株犬瘟熱病毒混合感染的情況。

3 臨床癥狀

由于傳染源不同導(dǎo)致水貂犬瘟熱潛伏期也不同，當(dāng)傳染源為貂屬動物時3～4 周就能引起廣泛傳播，并且癥狀嚴(yán)重，死亡率較高（圖1）[12]。根據(jù)發(fā)病的輕重緩急程度，臨床上可將犬瘟熱病程分為最急性型（猝死型）、急性型、慢性型和亞臨床型。最急性型是造成水貂猝死的重要原因之一，常伴有明顯的癲癇、肌肉僵直、抽搐和共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀[14-15]。急性型病程為1～10d，發(fā)病初期體溫升高至39.5～41.5 ℃，出現(xiàn)類似于感冒發(fā)燒的癥狀、皮膚炎癥與嚴(yán)重的消化不良，還會突然出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀；哺乳期的幼貂死亡率高達(dá)50%以上，育成后期的病貂有一定耐受性，可轉(zhuǎn)為慢性型。慢性型病程一般為2～4 周，典型癥狀是頭、四肢與頸部出現(xiàn)明顯病變（疹塊），足部會形成明顯“硬足掌癥”，水貂精神不佳、食欲不良、眼周圍干燥脫水嚴(yán)重，眼睛時而睜開、時而粘在一起。亞臨床型無明顯癥狀，類似感冒癥狀，1 周左右可耐過自愈，并能獲得免疫力。對病死水貂進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，皮膚增厚，腦膜出現(xiàn)出血性炎癥，內(nèi)臟器官出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，且胃腸黏膜出現(xiàn)卡他型炎癥，肝臟呈櫻桃紅色、腫大且有血斑，脾臟、腎臟和肺腫大、變形，膀胱出現(xiàn)充血、出血等現(xiàn)象[16-17]。

圖1 發(fā)病水貂伴有眼瞼水腫、有膿性分泌物癥狀Fig.1 Onset mink with eyelid edema and purulent discharge symptoms

4 診斷方法

4.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種利用引物對病原微生物的特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)，具有較高的特異性和敏感性，被廣泛應(yīng)用在病原微生物的檢測領(lǐng)域。2012 年，Yi 等[18]建立的RT-PCR 檢測方法能夠鑒別CDV 弱毒疫苗株和野毒株，這一技術(shù)對臨床流行病學(xué)具有重要的指導(dǎo)意義，可以區(qū)別出免疫感染和自然感染。同年，張洪亮等[19]進(jìn)一步優(yōu)化了RT-PCR 檢測方法，建立了一步法檢測犬瘟熱病毒，大大節(jié)省了檢測時間，可應(yīng)用于臨床檢測大批量樣品。2016 年，于紅鴿等[20]根據(jù)GenBank 中CDV-3N 蛋白基因序列，設(shè)計了特異性擴(kuò)增引物，不斷優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系，建立了一種水貂CDV快速、靈敏的RT-PCR 檢測方法。

與RT-PCR 檢測方法相比，熒光定量PCR（realtime PCR）具有高度的特異性、靈敏性和可重復(fù)性等特點(diǎn)，能夠診斷出家畜的多種病毒性疾病，被看作是獸醫(yī)病毒學(xué)和疾病控制的重要工具。2010 年，邢偉明等[21]建立了SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 檢測方法，能夠大規(guī)模高通量檢測犬瘟熱病毒，結(jié)果顯示檢測率和敏感性均高于普通RT-PCR 方法，且具有較好的重復(fù)率。2014年，金傳松等[22]根據(jù)CDV 核衣殼蛋白（NP）基因的保守序列，設(shè)計1 對特異性引物和1 條特異性探針，優(yōu)化了反應(yīng)體系，建立了TaqMan 熒光定量RTPCR 快速檢測CDV 的方法，該方法同樣具有良好的穩(wěn)定性和特異性。2014 年，劉毅[23]針對CDV 的H 基因和犬細(xì)小病毒（canine parvovirus,CPV）的VP2 基因，分別設(shè)計了2 對CDV/CPV特異性引物對和2 條TaqMan MGB 探針，建立了CDV、CPV 二重實(shí)時熒光定量PCR 檢測方法，該方法能夠同時對CDV 和CPV進(jìn)行實(shí)時定量分析。熒光定量PCR 雖然靈敏性高，但儀器設(shè)備和檢測成本相對較貴，不適用于CDV 的臨床檢測。2018 年，王介淞等[24]以CDV 野毒株N 基因保守區(qū)設(shè)計引物和探針，建立快速檢測水貂犬瘟熱病毒的TaqMan 熒光定量PCR 方法。通過敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和水貂外周血淋巴細(xì)胞感染犬瘟熱病毒的檢測發(fā)現(xiàn)該方法可成功檢測出水貂外周血淋巴細(xì)胞中的犬瘟熱病毒。

4.2 免疫學(xué)檢測

膠體金免疫層析技術(shù)（GICT）是一種將膠體金作為示蹤標(biāo)記物，并結(jié)合免疫檢測技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)，以硝酸纖維膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵在于抗體的準(zhǔn)備，目前已發(fā)展成為CDV診斷試紙條。膠體金技術(shù)可在5 min 內(nèi)完成CDV 的檢測，樣品采集和操作簡單、成本低，不需要特殊儀器設(shè)備，方便基層和現(xiàn)場使用以及在臨床推廣[25-26]。2011 年，房超等[27]考慮到犬源CDV 與水貂源CDV 差異較大，利用水貂源CDV 獲得的單克隆抗體，制備了膠體金檢測試紙條，發(fā)現(xiàn)其特異性良好。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種將抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)相結(jié)合的一種免疫學(xué)技術(shù)，既能檢測抗原也能檢測抗體，是最廣泛的血清學(xué)檢測方法，具有準(zhǔn)確、靈敏、特異、快速、批量檢測與成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于流行病學(xué)調(diào)查及免疫情況評估，且對臨床檢測非常有價值。目前，應(yīng)用于CDV 特異性抗原檢測的主要是抗體夾心ELISA 方法，應(yīng)用于CDV 特異性抗體檢測的主要是間接ELISA 方法[28]。2011 年，張鴻等[29]利用2 株CDV 特異性單克隆抗體，建立了夾心ELISA 方法檢測CDV 抗原，其具有良好的特異性和敏感性。2013 年，孫婧等[30]利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)獲得了CDV 單克隆抗體，建立了單克隆抗體夾心ELISA檢測方法，這一方法可快速診斷犬瘟熱病毒。在檢測CDV 抗體的ELISA 方法中，可以用全病毒包被作為抗原，也可以通過基因工程方法表達(dá)重組蛋白作為抗原。2009 年，王吉等[31]使用Vero 細(xì)胞體外培養(yǎng)CDV病毒，制備CDV特異性抗原，建立了CDV 抗體的ELISA方法，該方法重復(fù)性、特異性、敏感性與穩(wěn)定性較好，但由于CDV 在細(xì)胞的培養(yǎng)滴度低，不易制備，存在傳播病毒的安全隱患。2008 年，姜騫等[32]以CDV 重組的N蛋白為包被抗原，建立了間接的CDV抗體的ELISA方法。

4.3 水貂源犬瘟熱病毒的分離及鑒定

為研究水貂源犬瘟熱病毒的流行毒株，研究人員通過病料處理、病毒分離與培養(yǎng)、病毒TCID50的測定、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等方法檢測感染細(xì)胞中的病毒核酸，進(jìn)一步通過序列比對、間接免疫熒光（IFA）等方法成功分離并鑒定出犬瘟熱毒株。2013 年，徐聰?shù)萚33]對來自山東省濰坊市與諸城市某水貂養(yǎng)殖場采集的發(fā)病水貂肝、脾、肺和腦等組織進(jìn)行處理，通過RT-PCR 檢測確定是犬瘟熱病毒（CDV），同時經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)該病毒與NCBI 網(wǎng)站上發(fā)布的登錄號為EF042819、KC590511和KC667070 的毒株同源性均在96%以上，通過細(xì)胞培養(yǎng)傳代獲得病毒1 株，命名為CDV-SD。2014 年，莊金秋等[34]對山東省某貂場疑似CDV 感染的水貂肝臟等組織病料進(jìn)行了病毒分離、培養(yǎng)及鑒定，并將分離到的毒株命名為CDV LD-1 株。2018 年，趙益超等[35]取某水貂養(yǎng)殖場疑似犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒（MEV）混合感染病料，采用犬瘟熱抗原快速檢測試紙、HA 和PCR 及RT-PCR 法檢測CDV 和MEV，成功分離出一株細(xì)小病毒（MEV-RC02 株）和犬瘟熱病毒（CDV-RC01 株）。2018 年，王小龍等[36]從來自遼寧省大連市疑似犬瘟熱發(fā)病死亡水貂病料中成功分離并鑒定出1 株犬瘟熱毒株，將其命名為LNDL（17）M4 株。2020 年，劉彩紅等[13]從山東某水貂養(yǎng)殖場的發(fā)病水貂病料中，通過間接免疫熒光、電鏡負(fù)染及測序等方法鑒定得到4株犬瘟熱病毒，分別命名為WD1、WD2、WX1和WX2 株。

5 水貂犬瘟熱的防控

目前，水貂犬瘟熱尚無特效的治療藥物，最好的預(yù)防方法就是接種疫苗，科學(xué)的飼養(yǎng)管理、嚴(yán)格的消毒制度、盡早隔離治療與定期接種疫苗，對于防治犬瘟熱的發(fā)生十分重要[14,37]。應(yīng)用科學(xué)的飼料配方，既可以防止水貂出現(xiàn)營養(yǎng)不良的癥狀，又可以提高水貂的抵抗力。養(yǎng)殖場應(yīng)按照性別、年齡分散飼養(yǎng)，減少群體之間的接觸。疫病發(fā)生時，應(yīng)采取封閉的飼養(yǎng)方式，限制外來人員進(jìn)入養(yǎng)殖場，隔離飼養(yǎng)患病動物。做好日?；\舍的消毒工作，能夠有效清除飼養(yǎng)環(huán)境中的病原體。在春季或者犬瘟熱病毒流行時期，養(yǎng)殖場應(yīng)對已發(fā)生感染或者患病的水貂立即進(jìn)行隔離，并對其籠舍進(jìn)行徹底消毒。養(yǎng)殖場應(yīng)做到及時隔離治療患病水貂，以防繼發(fā)感染的發(fā)生。根據(jù)患病水貂的體重及個體大小，定量注射犬瘟熱高免血清，同時配合使用抗生素、抗病毒類藥物進(jìn)行治療。嚴(yán)格按照免疫程序接種疫苗，是預(yù)防犬瘟熱的有效手段。養(yǎng)殖場應(yīng)在母貂配種前和幼貂斷奶后進(jìn)行接種免疫，并可對斷奶后的幼貂適當(dāng)增加免疫劑量與次數(shù)。目前，犬瘟熱并無特異療法，抗生素?zé)o效，最好的預(yù)防方法就是早發(fā)現(xiàn)，早隔離，定期消毒，科學(xué)免疫。為防止繼發(fā)感染，應(yīng)對患病水貂進(jìn)行對癥治療，可使用磺胺類和抗生素藥物來控制細(xì)菌引起的并發(fā)癥?？墒褂寐让顾厮?、妥布霉素等眼藥水，用于治療患病水貂的眼、鼻。對于發(fā)生腸胃炎的患病水貂，可在飼料中混入卡那霉素進(jìn)行治療，每天2次，每只水貂劑量7 mg/kg（體重）。對于發(fā)生肺炎的患病水貂，可通過每日注射15 萬～20 萬單位的青霉素和鏈霉素進(jìn)行控制[14-15]。

6 結(jié)語與展望

近年來，我國毛皮動物感染犬瘟熱病毒引起的發(fā)病率和病死率呈明顯升高趨勢，給我國毛皮經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對CDV 的研究有很多，但對CDV 在水貂上的感染機(jī)制研究尚不充分。應(yīng)進(jìn)一步研究CDV在水貂上的感染機(jī)制和致病機(jī)理，研發(fā)出特效治療藥物，制定出合理、有效的治療方案，對該病的防控將起到較好的推動作用。預(yù)防CDV在水貂中流行最有效的方法就是接種疫苗，目前也在研發(fā)重組疫苗和亞單位疫苗。但是，由于母源抗體干擾、免疫接種程序不當(dāng)、疫苗質(zhì)量不過關(guān)、免疫劑量不足等原因，免疫接種失敗導(dǎo)致免疫水貂發(fā)病的現(xiàn)象一直存在。由此可見，提高養(yǎng)殖場工作人員對科學(xué)免疫知識和免疫程序的了解和認(rèn)知，是預(yù)防CDV在水貂中流行暴發(fā)的有效手段。對水貂CDV的快速檢測技術(shù)主要包括ELISA檢測試劑盒、膠體金檢測試紙條和PCR技術(shù)。臨床上廣泛應(yīng)用的膠體金檢測試紙條，其敏感性和準(zhǔn)確性需要進(jìn)一步提高，且檢測過程中容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性。分子生物檢測方法敏感性和特異性更高，能夠應(yīng)用于早期診斷，但由于設(shè)備和操作技術(shù)要求高，在基層和臨床應(yīng)用上普及較為困難。因此，研發(fā)一種成本低、操作簡便快捷的檢測方法，對于針對性控制犬瘟熱的流行和蔓延具有重要意義。