孟金柱，安清明，武淵勛，趙園園

(1.銅仁學院，貴州 銅仁 554300;2.山西普源泰奶牛養(yǎng)殖有限公司，山西 晉中 030800)

哺乳動物的卵泡是生殖系統(tǒng)的重要組成部分，它在控制發(fā)情周期、發(fā)情行為，確保卵母細胞發(fā)育能力及后期胚胎存活率、排卵后黃體功能和孕酮合成等方面起著重要作用[1]。在牛的1個發(fā)情周期中，卵泡生長特征呈現(xiàn)波的模式，常常會出現(xiàn)2～3個卵泡波[2]。直徑4～9 mm的有腔卵泡生長依賴于卵泡刺激素(FSH)，且在卵泡發(fā)育波出現(xiàn)之前，F(xiàn)SH濃度會發(fā)生短暫升高[3]。研究表明，牛卵泡內(nèi)的多種生長因子，如激活素、抑制素和胰島素樣生長因子(IGF)及其結(jié)合蛋白等，在調(diào)控卵泡中細胞的存活、增殖或凋亡過程中發(fā)揮了很重要的作用[4]。

牛卵泡含有卵母細胞(CC)、顆粒細胞(GCs)和膜細胞(TCs)。顆粒細胞和膜細胞合成的類固醇和肽激素分泌到細胞外基質(zhì)，發(fā)出一系列信號控制卵母細胞的發(fā)育和成熟，從而創(chuàng)造了一個決定卵母細胞質(zhì)量和成熟的微環(huán)境[5-6]。膜細胞通過細胞色素P450 17A1酶(CYP17A1)合成雄激素[7]，而顆粒細胞中的細胞色素P450 19A1酶(CYP19A1)負責將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(E)[8]。增強雌二醇(E2)產(chǎn)生的能力，對維持優(yōu)勢卵泡(DF)的生長和啟動性行為、促性腺激素濃度的升高、減數(shù)分裂的恢復和排卵至關重要[9]。牛卵泡發(fā)育過程中E2的產(chǎn)生受多種激素和生長因子調(diào)控，包括FSH[10]、IGF[11]、可卡因安非他命調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)[12]以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)[13]，但具體調(diào)控機制尚不清楚。

多種動物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制已經(jīng)通過Illumina測序被發(fā)現(xiàn)，如綿羊[14]、奶牛[15]和豬[16]。ROMEREIM等[17]對牛卵泡中顆粒細胞、膜細胞、大黃體細胞(LLCs)和小黃體細胞(SLCs)進行轉(zhuǎn)錄組測序及分析，篩選出促進黃體形成及參與卵泡發(fā)育的相關基因。鑒于此，通過Illumina平臺對牛DF和從屬卵泡(SF)中的顆粒細胞進行測序，篩選出卵泡發(fā)育相關的上調(diào)表達基因，對揭示牛特定的卵泡發(fā)育階段多種配體、受體和同源胞內(nèi)信號分子的表達差異，分析促進牛卵泡顆粒細胞增殖及調(diào)控E2分泌的關鍵因子具有重要意義，為進一步闡明調(diào)控優(yōu)勢卵泡被選擇的潛在機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

以山西省太谷縣普源泰奶牛養(yǎng)殖有限公司的黑白花奶牛為研究對象，在相同的飼喂條件下，選取6頭2歲齡健康母牛，同期發(fā)情并使用B超檢測每頭牛卵泡發(fā)育情況，送往屠宰場屠宰，然后采集每頭牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)與第二大卵泡(5～8 mm)，置于4 ℃杜氏磷酸緩沖液(DPBS)中，帶回動物繁殖生理實驗室。

1.2 方法

1.2.1 DF和SF的篩選 將采集到的6頭牛的最大卵泡與第二大卵泡分別放到6個盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，抽取卵泡液并使用ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)測定E2和孕激素(P)，根據(jù)最大卵泡和第二大卵泡卵泡液中E2和P的比值篩選出DF和SF，分別刮取其中的顆粒細胞。

1.2.2 總RNA提取、文庫構(gòu)建及測序 用RNA微量提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取3頭牛DF和SF顆粒細胞中的總RNA并純化，使用Agilent Bioanalyzer 2100檢測總RNA的完整性，Qubit 2.0 Flurometer測量濃度后，由北京諾和致源生物信息科技有限公司進行文庫構(gòu)建、Illumina測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)組裝及分析 將Illumina測序獲得的原始reads去除質(zhì)量低的、含N的、接頭等序列后，獲得干凈reads。干凈序列從頭組裝后得到unigenes序列，同時使用SOAP V2.0軟件將其比對到牛的參考基因組數(shù)據(jù)庫中，此時獲得mRNA。使用DESeq 2對獲得的mRNA進行差異表達分析，同時篩選出牛卵泡發(fā)育相關上調(diào)表達基因。用DAVID軟件對獲得的上調(diào)表達基因進行GO分析及KEGG信號通路分析。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄及引物合成 將Illumina測序剩余的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫對獲得的上調(diào)表達基因進行功能分析后，篩選6個可能與牛卵泡發(fā)育相關的基因，使用NCBI設計引物(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 供試引物序列Tab.1 Primer sequences for test

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用實時熒光定量PCR方法對牛DF與SF顆粒細胞中差異表達上調(diào)基因mRNA的相對表達情況進行驗證。每個樣品設5個重復，根據(jù)TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)使用說明書構(gòu)建20 μL PCR反應體系：模板cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Mix 10 μL，H2O 5 μL。反應程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。結(jié)果采用2-△△CT法計算，經(jīng)SPSS 17.0軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛DF和SF篩選結(jié)果

參照文獻[17]中篩選DF和SF的方法(最大卵泡卵泡液中E2/P>1，第二大卵泡卵泡液E2/P<1)，對每頭牛的最大卵泡和第二大卵泡卵泡液中E2和P進行測定，篩選出3頭牛的DF和SF(表2)。后續(xù)試驗采用這3頭牛的DF和SF顆粒細胞進行測序。

表2 牛DF和SF卵泡液中E2和P的測定結(jié)果Tab.2 Results of E2 and P in DF and SF follicular fluid in cattle

2.2 牛卵泡顆粒細胞中差異表達基因篩選

將測序結(jié)果與牛的參考基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得32 346個基因，分別將DF和SF顆粒細胞中的FPKM進行標準化，其中FPKM≥0.5的基因有13 243個。使用DESeq 2軟件對獲得的13 243個高表達基因進行差異表達分析，共得到194個上調(diào)表達基因，表3列出了其中差異表達倍數(shù)最高的20個基因及其功能。

表3 牛DF和SF顆粒細胞中差異倍數(shù)最高的20個基因Tab.3 Top 20 genes of fold change between DF and SF GCs in cattle

續(xù)表3 牛DF和SF顆粒細胞中差異倍數(shù)最高的20個基因Tab.3(Continued) Top 20 genes of fold change between DF and SF GCs in cattle

2.3 牛卵泡顆粒細胞中表達上調(diào)基因GO及KEGG分析

通過對牛卵泡顆粒細胞中上調(diào)表達基因進行GO功能富集分析，從而對可能促進卵泡發(fā)育的基因進行分類。應用DAVID軟件對獲得的194個表達上調(diào)基因進行GO分析,共分為3大類33組，其中參與生物學過程(Biological process)的基因占60.6%；與細胞組分(Cellular component)有關基因占21.2%，其中31個基因參與細胞質(zhì)功能；與分子功能(Molecular funtion)相關的基因占18.2%，其中18個基因參與金屬離子結(jié)合(表4)。

為了進一步得到促進卵泡發(fā)育有關基因的信號通路，使用DAVID軟件對表達上調(diào)基因進行KEGG信號通路分析，共發(fā)現(xiàn)4條通路(表5)，其中基因富集最為顯著的是軸突導向通路。

表4 牛DF和SF顆粒細胞中上調(diào)表達基因GO分析Tab.4 GO analysis of up-regulated genes in DF and SF GCs in cattle

續(xù)表4 牛DF和SF顆粒細胞中上調(diào)表達基因GO分析Tab.4(Continued) GO analysis of up-regulated genes in DF and SF GCs in cattle

表5 上調(diào)表達基因KEGG信號通路分析Tab.5 KEGG pathway analysis of up-regulated genes

2.4 實時熒光定量PCR分析

通過對篩選出來的6個具有代表性的上調(diào)表達基因進行相對定量分析，結(jié)果(圖1)表明，CYP19A1

**和*分別表示在P<0.01和P<0.05水平上差異顯著** and *represent significant difference at P<0.01 and P<0.05,respectively圖1 候選上調(diào)表達基因在牛DF和SF顆粒細胞中的相對表達量Fig.1 Relative expression of candidate up-regulated genes between DF and SF GCs in cattle

在DF顆粒細胞中的相對表達量極顯著高于SF(P<0.01)，TXNIP、BEX2和PRSS35在DF顆粒細胞中的相對表達量顯著高于SF(P<0.05)，與Illumina測序表達趨勢一致。EIF4EBP1和CHST11在DF和SF顆粒細胞中的表達趨勢與Illumina測序結(jié)果相反，但差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

哺乳動物在發(fā)育過程中，卵巢上最大的卵泡，即未來的優(yōu)勢卵泡持續(xù)生長、成熟并排出卵子[18]。有腔卵泡的生長，表現(xiàn)為通過在時間和空間上的有序組織來促進對促性腺激素的響應，這首先導致卵泡募集，并伴隨著卵泡波的出現(xiàn)，然后促進優(yōu)勢卵泡生長成為排卵卵泡[19]。研究表明，F(xiàn)SH和IGF-1等內(nèi)分泌因子是有腔卵泡發(fā)育的主要驅(qū)動因素[20]。但在每個卵泡波中，促進卵泡發(fā)育成為優(yōu)勢卵泡并排卵的分子調(diào)控機制尚不清楚。AUSTIN等[21]的研究結(jié)果表明，在牛發(fā)情周期的第1個卵泡波中，閉鎖卵泡分泌E2的能力會減弱。ASSEY等[22]在研究優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，卵泡液中雌激素在優(yōu)勢卵泡的生長發(fā)育過程中占主導作用；從屬卵泡最終會走向閉鎖，卵泡液中主要是P占主導作用。本研究分別測定最大卵泡與第二大卵泡中E2和P的濃度，采取最大卵泡卵泡液中E2/P>1和第二大卵泡卵泡液中E2/P<1來確定優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡。

LI等[23]應用Illumina測序技術對水牛不同大小的卵泡(直徑小于5 mm、5～8 mm、8～12 mm及大于12 mm)顆粒細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，卵泡的成熟和排卵可能會受到免疫控制。本研究通過對牛的優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡顆粒細胞進行測序，獲得194個上調(diào)表達基因。分別對上調(diào)表達基因進行GO功能富集、KEGG信號通路分析，從中篩選出6個基因，在牛的卵泡發(fā)育過程中可能會起促進作用。實時熒光定量PCR驗證分析結(jié)果顯示，CYP19A1在DF顆粒細胞中的相對表達量極顯著地高于SF (P<0.01)，PRSS35、BEX2和TXNIP在優(yōu)勢卵泡顆粒細胞中的相對表達量顯著地高于從屬卵泡 (P<0.05)，與Illumina測序所得到的結(jié)果基本一致。

CYP19A1作為細胞色素 P450 超家族蛋白成員之一，在雄激素合成雌激素過程中起到了重要的催化作用。FSH促進顆粒細胞表達CYP19A1，將膜細胞分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。BAO等[24]將小鼠CYP19A1基因敲除后發(fā)現(xiàn)，卵泡喪失了分泌雌激素的功能，但仍然能夠?qū)ν庠创萍に禺a(chǎn)生應答。敲除掉CYP19A1基因的小鼠，卵泡發(fā)育止步于腔前卵泡，從而導致小鼠不能排卵[25]。WAHLBERG等[26]通過基因芯片技術研究與小鼠排卵相關的蛋白酶時發(fā)現(xiàn)，PRSS35在排卵卵泡顆粒細胞中表達量極高，對卵泡排卵以及黃體的形成和退化起了促進作用。本研究中，PRSS35在牛DF中的表達量顯著高于SF，PRSS35作為上調(diào)基因促進卵泡生長，與WAHLBERG等[26]的研究結(jié)論相符。BEX2是BEX家族中重要的成員之一。ZHOU等[27]研究發(fā)現(xiàn)，BEX2可以促進U251細胞的增殖，敲除BEX2則會導致U251細胞凋亡。MENG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，降低BEX2的表達會引起線粒體凋亡，從而使細胞周期阻滯于G1期，導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，TXNIP在DF顆粒細胞中的表達量顯著高于SF，推測其可能會促進卵泡的發(fā)育并導致排卵。

本研究在牛DF和SF顆粒細胞中共獲得194個上調(diào)表達基因，結(jié)合功能分析，共篩選出6個卵泡發(fā)育相關上調(diào)的基因，并進行實時熒光定量PCR驗證，CYP19A1、TXNIP、BEX2和PRSS35在牛DF顆粒細胞中表達水平均比SF高，這些基因可能會促進卵泡的發(fā)育，最終引起卵泡排卵。