史保銀,劉新宇,邸 琳,史頂聰,秦海龍,趙宏宇,*,張鳳清,*

(1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012; 2.吉林省中醫(yī)藥科學院,吉林長春 130012; 3.吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司,吉林通化 134200)

酒精性肝病(ALD)可以被廣泛地描述為在慢性和過量的乙醇消耗后具有不同程度的肝功能損傷的病癥,在西方國家酒精性肝病是最常見的肝病,在我國酒精性肝病的發(fā)病率也在日益增加[1-2]。因此,對酒精性肝損傷的預防及治療變得尤為重要。葛根是我國傳統(tǒng)的解酒中藥,其主要成分為黃酮類化合物,含黃豆苷、黃豆苷原及葛根素等,具有保護肝細胞結構和功能完整性的作用,能有效調節(jié) mTOR 信號通路的激活[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),在酒精性中毒患者治療過程中加入中藥葛根,可顯著改善臨床表現(xiàn),而且具有良好的經濟性及可操作性[5]。葛根和水飛薊組合可改善酒精引起的肝脂肪變性,抑制肝炎[6]。甘草主要含有三萜類、黃酮類及甘草多糖類化合物,甘草甜素或其衍生物[7]歸因于其抗炎活性和抗氧化防御能力[8],有助于減輕與酒精有關的負面變化[9]。甘草酸差向異構體不同配比均具有不同程度的調節(jié)酒精性肝損傷脂質代謝的作用[10]。目前白芍保肝作機制的研究主要集中在芍藥苷對抑制炎性因子、調節(jié)免疫、抗細胞凋亡以及抗氧化應激[11]的調節(jié)作用方面,臨床前藥效學研究揭示了其對急性肝損傷、非酒精性脂肪肝等不同類型的肝損傷[12]均有保護作用,但對酒精性肝損傷的實驗研究目前仍存在空缺[13]。

實驗室擬研發(fā)一款對酒精性肝損傷有輔助保護功能的保健食品,命名為葛根護肝片,通過以往藥理活性篩選,結合中藥配伍理論,已確立了葛根、甘草和白芍的組方。本實驗以葛根、甘草、白芍不同配伍對酒精致急性肝損傷小鼠的血清VLDL及肝臟中MDA、GSH含量的影響結果為指標,采用L9(34)正交試驗篩選其最優(yōu)配伍,用數(shù)學模型設計組方配伍能分析出組方中的哪一種藥物對酒精性肝損傷輔助保護作用的影響更明顯,以及每種藥物最佳的生藥量[14-15]。考慮到按正交表安排的每一組實驗動物給藥劑量都是在一定范圍內變化的,所以進一步研究了最佳配伍各劑量對亞急性酒精性肝損傷小鼠的影響來驗證最優(yōu)配方的效果,以此優(yōu)化并確立配方中三種藥材的配伍,為葛根護肝片的研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級KM雄性小鼠(實驗動物生產許可證號:SCXK-(遼)2015-0001,120只,體質量18～21 g,實驗動物質量合格證號:211002300035188;70只,體質量18～21 g,實驗動物質量合格證號:211002300040738) 遼寧長生生物技術股份有限公司(試驗動物使用許可證號:SYXK(吉)2015-0009,由吉林省中醫(yī)藥科學院實驗動物倫理委員會審核通過,符合實驗動物倫理委員會規(guī)定);小鼠顆粒飼料 長春市億斯實驗動物技術有限責任公司(飼料生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001);葛根、甘草、白芍藥材 河北百合中藥飲片有限公司(經吉林省中醫(yī)藥科學院鑒定,葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根,白芍為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根;玉米淀粉 石家莊華辰淀粉糖生產有限公司;無水乙醇，乙酸(分析純) 北京化工廠;磷酸(色譜純) 天津市光復精細化工研究所；甲醇、乙腈(色譜純) 默克股份兩合公司；MDA試劑盒、GSH試劑盒、TG試劑盒、TC試劑盒、TBIL試劑盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、LDL-c試劑盒 南京建成生物工程研究所;VLDL ELISA試劑盒 武漢華美生物工程有限公司;葛根素標準品(以95.4%計)、芍藥苷標準品(以95.7%計)、甘草酸銨標準品(以97.7%計) 中國食品藥品檢定研究院。

DHG-9134BS-III電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械儀器設備有限公司;RE-52C系列旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司;DNM-9602型酶標儀 北京普朗新技術有限公司;723可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;HC-3618R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;SSW-600-2S型電熱恒溫水槽 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;JA2003B型千分之一電子天平 上海越平科學儀器有限公司;PerkinElmer液相色譜儀 美國珀金埃爾默股份有限公司;Ultimate XB-C18(250×4.6 mm) 月旭科技(上海)股份有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根護肝片配伍正交設計 2015年版《中國藥典》中葛根飲片用量10～15 g,白芍飲片用量6～15 g,甘草飲片用量2～10 g,以葛根、甘草、白芍三個原料作為因素,各自生藥用量(每日推薦人體使用量)作為水平,結合預實驗篩選結果,設計四因素三水平正交試驗,進行配方優(yōu)選,因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment design

1.2.2 不同配伍葛根護肝片的制備 根據表1進行配比,每組配方的生藥總量為人一日用量(生藥量),按生藥總量的15倍放大提取。提取條件為:藥材加入10倍量的70%乙醇溶液浸泡30 min,微沸狀態(tài)回流提取3次,每次1.5 h,濾液合并,干燥粉碎,以玉米淀粉補足至63 g(擬定護肝片人每日推薦用量為4.2 g)。性狀:黃色粉狀,微溶于水(震蕩可懸浮)。灌胃液體:受試樣品均用 0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液配制。

1.2.3 葛根護肝片對急性酒精性肝損傷小鼠影響實驗 實驗動物購入后自由進食、飲水適應3 d后進行實驗。120只小鼠隨機分為10組,分別為對照組和實驗組,每組12只。對照組每日上午灌胃0.5% CMC-Na水溶液。實驗組小鼠每日灌胃正交樣品1～9號,葛根保肝片推薦人每日食用量為4.2 g,小鼠灌胃劑量按人體同體重推薦量的20倍(人體重以60 kg計),既灌胃劑量為4.2/60×20=1.4 g/kg·BW,連續(xù)灌胃四周,每周稱重2次,灌胃體積隨體重調整(10 mL/kg·BW)。

給予小鼠受試樣品27 d,第28 d禁食不禁水6 h后,所有小鼠灌胃50%乙醇,灌胃體積為12 mL/kg·BW。在給予酒精15 h后給予受試物,再1 h后摘除眼球取血,離心取血清,保存?zhèn)溆谩ｎi椎脫椎處死,摘取肝臟,截取合適大小肝塊稱重,以肝葉重量10 倍體積的生理鹽水研磨肝葉,研磨液4 ℃放置過夜,離心,取上清液備用。

對急性酒精性肝損傷小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量進行測定,并進行酒精性肝損傷保護作用綜合評分,評分標準如下:以每組小鼠指標的均值作為統(tǒng)計值,評分時,每項指標以對照組均值作為0分,以實驗組中最優(yōu)組的均值作為100分;MDA、GSH、VLDL含量評分各占綜合評分的1/3。以保肝綜合評分為指標進行正交實驗的方差分析及極差分析,考察最優(yōu)配伍組合。為驗證最優(yōu)配伍對酒精性肝損傷的作用,同時進一步研究該配伍對乙醇所致小鼠亞急性酒精肝損傷的影響,進行了后續(xù)實驗。

1.2.4 亞急性酒精性肝損傷小鼠實驗 灌胃藥品為正交試驗最優(yōu)葛根護肝片配伍。灌胃樣品制備:以最優(yōu)配伍組合生藥總量的15倍放大提取(生藥總量為人一日用量),配方工藝條件同1.2.2,以玉米淀粉補足至45 g(擬定護肝片人每日推薦用量為3.0 g)。

實驗動物購入后自由進食、飲水適應3 d后進行實驗。70只小鼠隨機分為5組,分別為對照組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組,每組14只。對照組和模型組每日上午灌胃0.5% CMC-Na水溶液,高、中、低劑量組灌胃樣品的劑量分別為人每公斤體重的20、10、5倍(人體重以60 kg計),即(3.0/60×20=1.00、3.0/60×10=0.50、3.0/60×5=0.25)1.00、0.50、0.25 g/kg·BW,所有小鼠灌胃體積均為10 mL/kg·BW。給予28 d,從第15 d開始,每日下午除對照組外,另4組灌胃給予30%乙醇10 mL/kg,末次給藥后采血,分離血清,取肝臟稱量重量,摘取最大葉分成2份,研磨肝臟,另取一葉4%甲醛固定,進行病理組織學檢查,計算肝臟系數(shù),測定血清中TG、TC、TBIL、VLDL、LDL-c含量、GOT、GPT活性,測定肝臟中GSH含量。

1.2.5 血清及肝臟中各指標含量及活性檢測 血清中TG含量采用甘油磷酸氧化酶法(GPO-PVP)檢測、TC含量采用葡萄糖氧化酶法(GOD-PAP)檢測、TBIL含量采用釩酸氧化法檢測、VLDL含量采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測、LDL-c含量采用直接法檢測、GOT及GPT活性采用賴氏法進行檢測;肝臟中MDA含量采用硫代巴比妥酸比色(TRA)法檢測、GSH-Px含量采用比色法進行測定。

1.2.6 葛根護肝片最優(yōu)配伍提取物中葛根素、芍藥苷、甘草酸含量測定 功效成分含量檢測及方法學研究參考2015版《中國藥典》、GB/T 22251-2008、《保健食品功效成分檢測方法》(白鴻 主編)、《保健食品功效成分檢測技術與方法》(馬雙成 等主編),并在此基礎上進行了適應性改進。

1.2.6.1 葛根素測定 對照品溶液的配制:精密稱取葛根素對照品適量,加甲醇制成每1 mL含葛根素0.08 mg的溶液。

供試品溶液的制備:取約0.9 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入30%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過,取續(xù)濾液。

測定條件:進樣量:5 μL;流動相:甲醇-(36%乙酸∶水=3∶27,V/V)(78∶22,V/V);檢測波長:247 nm;柱溫:25 ℃;流速:0.8 mL/min。

1.2.6.2 芍藥苷測定 對照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷對照品適量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成芍藥苷質量濃度為0.32 mg/mL的對照品儲備液,置于4 ℃的冰箱中備用。使用前取一定量的對照品儲備液,以甲醇為稀釋液稀釋至芍藥苷濃度為60 μg/mL標準溶液。

供試品溶液的制備:取約1.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用乙醇補足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過,取續(xù)濾液,即得。

測定條件:進樣量:5 μL;流動相:以0.1%磷酸水溶液為流動相A,以80%乙腈為流動相B,按下表進行梯度洗脫。檢測波長:230 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。

表2 流動相梯度Table 2 Gradient of mobile phase

1.2.6.3 甘草酸測定 對照品溶液的制備:精密稱取甘草酸銨對照品適量,置于20 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成甘草酸銨質量濃度為 0.32 mg/mL的對照品儲備液,置于4 ℃的冰箱中備用。使用前取一定量的對照品儲備液,以甲醇為稀釋液稀釋至甘草酸銨濃度為80 μg/mL 標準溶液。

供試品溶液的制備:取約1.9 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用乙醇補足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過,取續(xù)濾液,即得。

測定條件:進樣量:10 μL;流動相:以0.05%磷酸水溶液為流動相A,以80%乙腈為流動相B,按下表3進行梯度洗脫;檢測波長:237 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。

表3 流動相梯度Table 3 Gradient of mobile phase

1.3 數(shù)據處理

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果及最優(yōu)配伍分析

急性酒精性肝損傷小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量測定及評分結果見表4。

表4 各組小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH的含量及各指標評分Table 4 Scores of serum VLDL and MDA,GSH in liver of mice in each group

以保肝綜合評分為指標,考察最優(yōu)配伍組合,正交試驗和方差分析結果見表5、表6。由表 5 知,各因素水平 kA2>kA3>kA1,kC1>kC3>kC2,kD1>kD2>kD3,所以最優(yōu)配伍組合為 A2C1D1,既葛根4 g,甘草 2 g,白芍2 g。表6可知,對考察指標影響的主要因素是配伍中葛根,其次是甘草,影響最小的是白芍。

表5 正交試驗設計及極差分析Table 5 Orthogonal experimental design and range analysis

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.2 對小鼠亞急性酒精性肝損傷的影響

2.2.1 對小鼠血清中TC、TG、LDL-c和VLDL含量的影響 由表7可知,與對照組比較,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-c及VLDL含量均顯著升高(P<0.05),結合表8模型組小鼠血清中TBIL含量顯著升高(P<0.05)情況可判定亞急性酒精性肝損傷模型成立。

表7 各實驗組小鼠血清中TC、TG、LDL-c和VLDL含量Table 7 Contents of TC,TG,LDL-c and VLDL in serum of mice in each experimental group

表8 各實驗組小鼠血清中TBIL含量及GOT、GPT活性Table 8 Content of TBIL and activity of GOT,GPT in serum of mice in each experimental group

從表7的數(shù)據中可以看出,各劑量對小鼠亞急性酒精性肝損傷均有一定的改善作用。中劑量效果最佳,組內小鼠血液中各項指標含量均有降低(P<0.05)。其次為低劑量,可有效降低小鼠體內TG及LDL-c含量(P<0.05)。高劑量組各指標含量均有降低,但與模型組相比無顯著差異。說明葛根、甘草、白芍最優(yōu)配伍可改善乙醇誘導小鼠肝臟損傷造成的脂代謝異常。同時表明該配伍與其改善小鼠酒精性肝損傷作用的量效關系不成正比,預防及改善酒精性肝損傷不能簡單的增加其劑量,需要進一步研究。

2.2.2 對小鼠血清中TBIL、GOT及GPT水平的影響 由表8可知,與對照組比較,模型組小鼠血清中TBIL含量顯著升高(P<0.05),GPT和GOT活性無明顯變化。肝細胞具有攝取、結合、運輸TBIL的功能[16-17]。乙醇致小鼠肝細胞受損后,其攝取、結合、排泄TBIL的功能下降,使得血液中的TBIL積累,模型組小鼠血清中的TBIL含量顯著升高(P<0.05),而最優(yōu)配伍各劑量均能顯著降低小鼠血清中TBIL的含量(P<0.05),證明肝細胞受損情況得以改善,功能趨于正常,其中中劑量效果最佳。GPT、GOT活性是評價肝細胞損害程度的指標[18]。GPT存在于胞漿中,GOT存在于線粒體中,肝細胞被破壞時,血清中GPT、GOT的濃度升高[19]。當肝細胞無明顯壞死,而僅有肝細胞膜的通透性增加時,血中GOT的濃度亦可明顯增高,是酒精性肝損傷的敏感指標之一。模型組小鼠血清中的GPT、GOT活性與對照組無明顯差異,而各劑量組小鼠血清中GPT、GOT活性與模型組相比雖無顯著差異,但確有所下降,表明長期給小鼠灌胃濃度為30%的乙醇,小鼠的肝臟會逐漸適應代償,肝細胞膜或線粒體不會破裂[20],與趙敏等[21]的研究結果一致,而葛根護肝片能在改善脂代謝的同時保護小鼠肝細胞不受損。

2.2.3 對小鼠肝臟指數(shù)及GSH水平的影響 由表9可知,與對照組比較,模型組小鼠體肝臟指數(shù)明顯增大,肝臟中GSH含量明顯升高,差異均顯著(P<0.05)。與模型組相比,各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)與GSH含量無明顯差異。

表9 各實驗組小鼠的肝指數(shù)及肝組織中GSH的含量Table 9 Liver index and the content ofGSH in the liver of each experimental group

GSH作為抗氧化酶的輔助因子,在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[22]。在實驗中后期給小鼠灌胃 30% 乙醇,主要目的是給予肝臟代謝壓力[23-24]。由表9可知,模型組小鼠的肝臟有顯著性的增重(P<0.05),并且小鼠肝臟中儲藏的還原型物質 GSH 較高,結合肝臟指數(shù)及GSH含量兩個指標來看,這可能是由于小鼠為適應乙醇的攝入,嘗試增加肝臟中的功能組織細胞,提高了合成GSH的能力,機體的抗氧化能力也隨之升高。與模型組相比,各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均略有上升,推測葛根護肝片最優(yōu)配伍可能有輔助小鼠增加肝臟中功能組織細胞的作用,加快了GSH的合成,對抗自由基脂質過氧化反應,阻止肝細胞脂質過氧化,維持細胞質膜的正常結構,保護肝細胞免受損傷。雖然給小鼠灌胃的是葛根、甘草、白芍三種藥材提取的混合物,存在除有效成分外的其他物質增加肝臟代償負擔的可能性,考慮到其篩選出的最優(yōu)配伍中劑量能有效的降低小鼠血清中TC、TG、LDL-c及TBIL各指標的含量,該可能性不高。

2.2.4 對小鼠肝臟組織病理變化影響 如圖1a所示,正常對照組小鼠的肝內可見多個肝小葉,肝索及肝竇排列整齊,匯管區(qū)三種管道結構清楚可見,無明顯異常,呈正常肝組織結構。模型組小鼠的肝細胞以氣球樣變性為主,同時可見肝細胞胞漿疏松。比較正常對照組,模型組肝細胞損傷明顯(圖1b);證明肝損傷的模型復制是成功的。圖1c中高劑量組小鼠的肝細胞變性程度明顯減輕,未見肝細胞壞死,未見炎細胞浸潤;比較模型組,高劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。如圖1d,中劑量組小鼠的肝細胞變性的程度得到有效減輕,肝細胞以疏松變性為主,未見肝細胞壞死,未見炎細胞浸潤;比較模型組,中劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。圖1e中低劑量組小鼠的肝細胞氣球樣變的程度得到得到有效的減輕,可見肝細胞以疏松變性,未見肝細胞壞死,未見炎細胞浸潤;比較模型組,低劑量組可以在一定程度上減輕肝損傷的程度。由此可知,葛根護肝片高劑量對小鼠酒精性肝損傷的輔助保護作用較好,中劑量組效果較好,低劑量可以在一定程度上減輕肝損傷。

圖1 各實驗組小鼠肝組織形態(tài)的比較(400×)Fig.1 Comparison of liver histology in mice from each experimental group(400×)

2.3 葛根護肝片最優(yōu)配伍提取物中葛根素、芍藥苷、甘草酸含量測定結果

葛根藥材中葛根素含量為6.0%、白芍藥材中芍藥苷含量為2.3%、甘草藥材中甘草酸含量為2.1%;經計算該樣品(制備見1.2.4)中含有葛根素6.57%、芍藥苷1.01%、甘草酸1.01%(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

3 討論與結論

中藥配伍不同,其作用效果也有差異[25]。本研究以急性酒精性肝損傷小鼠其血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量的綜合評分為指標,采用L9(34)正交試驗來分析葛根護肝片中三種藥材的最優(yōu)配伍,該配伍為葛根4 g、白芍2 g、甘草2 g,提取物中含有葛根素196.98 mg、芍藥苷30.45 mg、甘草酸30.44 mg。在亞急性酒精性肝損傷小鼠模型成立的前提下,中劑量組小鼠血清TC、LDL-c和TBIL含量與模型對照組比較降低,差異有顯著性(P<0.05),判定該指標結果陽性,即可判定該葛根護肝片最優(yōu)配伍對亞急性酒精性肝損傷有輔助保護功能。綜合二實驗可判定該葛根護肝片配伍具有有助于降低酒精性肝損傷危害功能。

ALD的發(fā)病機制比較復雜,目前研究認為其發(fā)病機制主要為機體反復多次過量攝入酒精,乙醇可通過誘導CYP4502E1,引起氧化應激、脂質過氧化、代謝、營養(yǎng)紊亂等一系列復雜反應,導致肝細胞的功能損傷,進而引起肝組織中甘油三酯含量聚積,膽固醇合成加強,并引起相應載脂蛋白含量的改變。降低肝臟運出脂肪的功能后,乙醇還可增加脂肪組織的脂肪動員,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血癥。血脂代謝異常表現(xiàn)為血清中TC、TG[26]和載體蛋白(LDL-c、VLDL)含量升高等的變化[27-28]。

與亞急性酒精性肝損傷模型組比較,最優(yōu)配伍的中劑量(0.50 g/kg·BW)可使小鼠血清中GPT和GOT的活性有所降低,對肝指數(shù)和GSH含量無明顯影響,可使小鼠血清中TC、TG、LDL-c及TBIL含量顯著降低(P<0.05),VLDL含量極顯著降低(P<0.01),低劑量可使小鼠血清中TG、LDL-c及TBIL含量顯著降低(P<0.05),高劑量可使小鼠血清中TBIL含量顯著降低(P<0.05),即中劑量組顯示出明顯的護肝效果,且效果優(yōu)于低、高劑量組,小鼠酒精性肝損傷情況有明顯的改善,其作用機制可能與增加抗機體抗氧化能力及改善肝臟脂質代謝有關。本研究結果為葛根、甘草、白芍開發(fā)為對酒精性肝損傷有輔助保護功能的保健食品或藥品提供了重要的實驗依據,但本實驗所用藥材提取物為粗提物,其解酒護肝的有效成分和作用機制還需要更進一步的研究。