霍雯 李佳蜜 徐小萍 賴瑞聯(lián) 陳曉慧 林玉玲 陳裕坤 賴鐘雄

摘? 要：本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，根據龍眼轉錄組數據庫，采用RACE-PCR和RT-PCR技術獲取龍眼DlICE1 cDNA全長序列，并對其進行生物信息學分析與低溫脅迫下表達分析。結果表明，龍眼DlICE1 cDNA全長為2327 bp，其中開放式閱讀框（ORF）序列長1614 bp，共編碼537個氨基酸。生物信息學分析表明，龍眼DlICE1編碼的蛋白質屬于不穩(wěn)定的弱酸性蛋白，不具有典型的信號肽，且不屬于分泌蛋白;亞細胞定位表明其位于細胞核內，與甜橙的同源蛋白親緣關系最近;實時熒光定量PCR表明，龍眼DlICE1能夠有效響應低溫脅迫，低溫誘導其表達量提高。研究結果顯示，龍眼DlICE1基因參與龍眼胚性愈傷組織抗寒過程。

關鍵詞：龍眼;胚性愈傷組織;DlICE1基因;基因克隆;實時熒光定量PCR

中圖分類號：S667.2? ? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression of Low Temperature Stress of DlICE1 in Dimocarpus longan Lour.

HUO Wen， LI Jiami*， XU Xiaoping， LAI Ruilian， CHEN Xiaohui， LIN Yuling， CHEN Yukun，

LAI Zhongxiong**

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 35002， China

Abstract： In this experiment， the embryogenic callus of longan were used as the materials， the cDNA sequence of DlICE1 was cloned from longan embryogenic callus by the method of RACE-PCR and RT-PCR， then it was analyzed by bioinformatical methods and expression analysis under low temperature stress. The full-length sequence of DlICE1 was 2327 bp， which contained an 1614 bp open reading frame encoded 537 amino acids. The bioinformatics analysis indicated that DlICE1 belonged to the unstable acidic protein， which didnt has a typical signal peptide and wasnt a secreted protein; subcellular localization indicated that it is located in the nucleus， which was closest to the homologous protein of sweet orange. The qRT-PCR results indicated that the longan DlICE1 could effectively respond to low temperature stress and induce increased expression at low temperature. In summary， the study suggests that the longan DlICE1 gene may be involved in the cold resistance in longan embryogenic callus.

Keywords： Dimocarpus longan Lour.; embryogenic callus; DlICE1 gene; gene cloning; real-time fluorescent quantitative PCR;

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.016

植物在生長發(fā)育過程中，不斷受到各種非生物脅迫而嚴重影響作物的產量、品質以及生長發(fā)育。低溫是一類重要的非生物因子，可以使植物受到不同程度的傷害甚至死亡。很多植物在寒冷環(huán)境下長期生長逐漸進化形成了一套感受和傳導寒冷信號的系統(tǒng)，并能夠產生一系列適應寒冷環(huán)境的變化，以增強抗寒能力[1]。低溫誘導植物抗寒性提升的過程稱為冷馴化[2]，Weiser等[3]首次提出植物在冷馴化過程中基因表達發(fā)生改變的觀點。

CBF轉錄因子調控信號路徑是目前為止研究最廣泛、最受認可的非依賴于ABA途徑的轉錄因子之一。具體過程為ICE1（inducer of CBF expression 1）——CBF轉錄因子——CRT/DRE（C- repeat binding factor/dehydration-responsive element binding）基序——冷誘導基因COR（cold- regulated）表達——植物抗寒性提升。ICE1基因屬于bHLH基因家族，能編碼一種特定蛋白結合到CBF3基因啟動子的MYC順式元件上，進而誘導CBF3編碼CBF轉錄因子，CBF與COR基因的順式作用元件結合，促使COR下游基因表達，進而提高植株抗寒能力[4]。故ICE1的過量表達可以使植物抗寒能力提高[5]。在低溫脅迫下，過表達水稻RsICE1可以使其下游冷調控基因OsD REBL和OsTPP1在轉錄水平上顯著上調，說明RsICE1參與了CBF/DREB1冷調控信號網絡[6]。王意程等[7]發(fā)現(xiàn)低溫處理有利于蘋果愈傷組織花青苷的累積;低溫可以誘導蘋果愈傷組織冷信號基因MdICE1以及花青苷合成相關轉錄因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表達。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus）植物，屬于亞熱帶果樹，喜溫懼冷，年均適應生長的溫度為20～22 ℃。溫度是影響龍眼生長、結實的重要因素，對其產量和品質均會造成不利影響。因此，研究龍眼抗寒相關基因，有助于進一步探討龍眼抗寒機理的相關問題，對提高龍眼產量、品質有著重要意義。本研究以龍眼‘紅核子胚性愈傷組織及其轉錄組數據為材料和基礎，對DlICE1基因進行克隆以及生物信息學分析，同時采用qRT-PCR技術檢測不同溫度處理下DlICE1的表達情況，以期為龍眼抗寒機制的后續(xù)研究提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供的‘紅核子品種龍眼胚性愈傷組織（LC2細胞系）[8]。龍眼胚性愈傷組織的轉錄組數據GenBank登錄號為SRA059205。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 將生長狀態(tài)良好的龍眼胚性愈傷組織置于不同溫度條件下暗培養(yǎng)24 h，設置的溫度梯度為0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 ℃。暗培養(yǎng)完成后將材料放入液氮中冷凍15 min，隨后放入?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 總RNA提取及cDNA第一鏈合成? 采用Tripure法提取龍眼胚性愈傷組織總RNA，經超微量分光光度計測定RNA濃度及吸光值（OD值），以A260/A280下OD值在1.8～2.0之間的測定結果為宜;采用SMART RACE試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA第一鏈用于基因克隆;采用TaKaRa公司提供的熒光定量試劑盒逆轉錄成cDNA用于qRT-PCR實驗。

1.2.3? 引物設計? 從龍眼轉錄組數據庫中查找、提取DlICE1已有的部分轉錄組序列（1599 bp），將其序列在NCBI數據庫中BLAST，與其他物種進行同源性對比。下載DlICE1基因同源性較高的幾個序列，如甜橙（Citrus sinensis）、楊樹（Populus trichocarpa）、胡楊（Populus euphratica）等，進行DNAMAN同源對比，參考PCR引物設計原理，運用DNAMAN 6.0軟件設計3′RACE、5′RACE及全長驗證引物，同時根據全長驗證獲得序列結合實時熒光定量PCR引物設計原則設計實時定量引物（表1），并將引物序列發(fā)送至北京六合華大基因有限公司進行引物合成。

1.2.4? 目的基因的擴增? 以逆轉錄的龍眼cDNA為模板，將酶、通用引物、設計的RACE引物和無菌水同時加入PCR反應體系進行PCR擴增。PCR反應體系為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。參照林玉玲[9]的試驗方法，將獲得的PCR產物目的片段用1%凝膠電泳鑒定條帶是否為目的片段，切割目的片段，進行膠回收，PMD18-T載體進行目的片段的連接，隨后在目的片段連接產物中加入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，進行目的基因的轉化;將轉化后的產物進行涂板，使其在含LB加Amp的培養(yǎng)板上培養(yǎng)12 h，隨后進行挑菌，挑取多個單克隆，進行菌液PCR驗證，經凝膠電泳驗證，將陽性克隆子發(fā)送給上海博尚生物技術有限公司進行基因測序。

1.2.5? 生物信息學分析? 對克隆得到的基因序列使用DNAMAN獲得對應氨基酸序列。采用ExPASy對DlICE1蛋白進行基本理化性質分析;采用SignalP 4.0 Server進行信號肽預測;采用Prot Comp進行亞細胞定位分析;采用TMHMM分析蛋白跨膜結構域;采用NCBI-Protein Tools進行蛋白質保守結構域預測;采用NetPhos 2.0 Server進行磷酸化位點與其他功能位點預測;利用COILS Server預測卷曲結構;利用Jpred3預測蛋白二級結構;利用SWISS-MODEL預測蛋白三級結構;采用MEGA 6.0進行同源性和分子系統(tǒng)進化樹分析;使用MEGA 6.0將以上序列載入，采用采用最小鄰近法，設置Bootstrap為1000進行分子同源系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR表達分析? 按照趙雙宜等[10]建立的方法分別提取不同溫度處理后的龍眼胚性愈傷組織總RNA并編號，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用PrimeScript? RT Reagent Kit（TaKaRa）試劑盒進行cDNA逆轉錄。實時熒光定量反應參照Lin等[11-12]的步驟方法進行，以龍眼EIF4a、EF-la和FSD作為內參基因，采用羅氏LightCyclers? 480和SYBR? Prumix EX Taq? Ⅱ對不同溫度處理下龍眼DlICE1基因進行qRT-PCR實驗，重復3次。最后按照Livak[13]等的方法進行定量計算，并通過Excel軟件對Cp值進行統(tǒng)計分析與圖標制作，采用SPSS 19.0進行數據顯著性差異分析。

2? 結果與分析

2.1? 龍眼DlICE1 cDNA全長序列獲得

以龍眼‘紅核子胚性愈傷組織為材料提取總RNA并進行反轉錄，采用RACE-PCR技術進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條目的條帶，5′-RACE和3′-RACE所得片段長度分別約為500 bp和400 bp，與目的片段大小一致，產物電泳結果如圖1所示。

拼接后進行全長驗證，獲得龍眼DlICE1 cDNA序列全長為2327 bp，其中ORF區(qū)域長度為1614 bp，編碼537個氨基酸。將所得cDNA序列在NCBI上進行在線BLAST同源性比對，結果顯示該序列與其他物種的DlICE1基因同源性均較高，其中與甜橙和河岸葡萄的ICE1同源性最高，其相似率都高達82%，試驗結果可確認所得序列為龍眼DlICE1基因的序列。運用DNAMAN獲取ORF序列和氨基酸序列如圖2所示。

隨著近期龍眼基因組的公布[28] ，人類對龍眼的認識取得突破性進展，以后的科研試驗可以從基因組水平上對龍眼的生長發(fā)育和進化起源等重大問題入手，有利于新基因的發(fā)現(xiàn)與物種的改良等。在此研究基礎上，結合龍眼基因組數據的運用，研究ICE1基因與其他相關基因在龍眼抗寒過程中的相互作用以及培育龍眼抗寒新品種有了新方向。

參考文獻

向殿軍， 滿麗莉， 張? 娣， 等. LsICE1基因表達及調控轉基因水稻抗冷通路研究[J]. 核農學報， 2013， 27（10）： 1424- 1430.

Chinnusamy V， Zhu J， Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants[J]. Trends in Plant Science， 2007， 12（10）： 444-451.

Weiser R L， Wallner S J， Waddell J W. Cell wall and extensin mRNA changes during cold acclimation of pea seedlings[J]. Plant Physiology， 1990， 93（3）： 1021-1026.

劉德春. 枳PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2基因克隆及PtrICE1遺傳轉化研究[D]. 武漢： 華中農業(yè)大學， 2010.

Chinnusamy V， Ohta M， Kanrar S， et al. ICE1： a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Genes and Development， 2003， 17（8）： 1043-1054.

Man L， Xiang D， Wang L， et al. Stress-responsive gene RsICE1， from Raphanus sativus， increases cold tolerance in rice[J]. Protoplasma， 2017， 254（2）： 945-956.

王意程， 王? 楠， 許海峰， 等. 紅肉蘋果冷信號基因MdICE1的表達及其蛋白與MdMYB的互作[J]. 園藝學報， 2018， 45（5）： 817-826.

賴鐘雄， 潘良鎮(zhèn)， 陳振光. 龍眼胚性細胞系的建立與保持[J]. 福建農業(yè)大學學報， 1997（2）： 33-40.

林玉玲. 龍眼體胚發(fā)生過程中SOD基因家族的克隆及表達調控研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2011.

趙雙宜， 吳耀榮， 夏光敏. 介紹一種簡單高效的植物總RNA提取方法[J]. 遺傳， 2002（3）： 337-338.

Lin Y L， Lai Z X. Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J]. Plant Science， 2010， 178（4）： 359-365.

Lin Y L， Lai Z X. Comparative analysis reveals dynamic changes in miRNAs and their targets and expression during somatic embryogenesis in longan （Dimocarpus longan Lour.）[J]. PLoS One， 2013， 8（4）： e60337.

Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

蔣? 瑤， 陳文波， 周澤斯， 等. 植物抗寒轉錄激活因子ICE1和ICE2基因的生物信息學分析[J]. 貴州農業(yè)科學， 2015， 43（3）： 24-30.

林元震， 郭? 海， 劉純鑫， 等. 赤桉抗寒轉錄因子ICE1基因的分子克隆與表達分析[J]. 植物生理學報， 2011， 47（5）： 488-494.

林元震， 張志毅， 劉純鑫， 等. 甜楊抗凍轉錄因子ICE1基因的in silico克隆及其分析[J]. 分子植物育種， 2007（3）： 424-430.

趙玲玲. 蘋果MdSAMDC2和MdICE1基因的功能鑒定以及抗逆性研究[D]. 泰安： 山東農業(yè)大學， 2007.

向殿軍， 殷奎德， 滿麗莉， 等. 大白菜低溫脅迫轉錄因子BcICE1的克隆及表達分析[J]. 分子植物育種， 2011， 9（3）： 364-369.

Wang X， Liu S， Liu X， et al. Molecular cloning and characterization of a CBF gene from Capsella bursa-pastoris[J]. DNA Sequence， 2004， 15（3）： 180-187.

張騰國， 常? 燕， 王? 娟， 等. 油菜BnICE1的克隆及表達分析[J]. 中國農業(yè)科學， 2013， 46（1）： 205-214 .

鄭銀英， 崔百明， 常明進， 等. 轉擬南芥ICE1基因增強煙草抗寒性的研究[J]. 西北植物學報， 2009， 29（1）： 75- 79.

黃? 瑩， 徐志勝， 王? 楓， 等. 胡蘿卜低溫脅迫轉錄因子DcICE1基因克隆與非生物逆境響應分析[J]. 西北植物學報， 2015， 35（1）： 30-36.

時? 慧. 茶樹ICE1基因的克隆及轉擬南芥功能驗證[D]. 青島： 青島農業(yè)大學， 2013.

曹慧明， 史作民， 周曉波， 等. 植物對低溫環(huán)境的響應及其抗寒性研究綜述[J]. 中國農業(yè)氣象， 2010， 31（2）： 310-314， 319.

Dong C H， Agarwal M， Zhang Y， et al. The negative regulator of plant cold responses， HOS1， is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2006， 103（21）： 8281-8286.

Miura K， Rus A， Sharkhuu A， et al. The Arabidopsis SUMO E3 ligase SIZ1 controls phosphate deficiency responses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2005， 102（21）： 7760-7765.

肖小娥， 徐小萍， 李佳蜜， 等. 龍眼胚性愈傷組織DlHOS1基因克隆與表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（2）： 293-299.

Lin Y， Min J， Lai R， et al. Genome-wide sequencing of longan （Dimocarpus longan Lour.） provides insights into molecular basis of its polyphenol-rich characteristics[J]. Gigascience， 2017， 6（5）： gix023.