黃江麗，何 力，計(jì)少石，張志紅，彭 建，丁建南，張華琦，圣 平*

(1.江西省科學(xué)院生物資源研究所，330096，南昌；2.樂平市三王牧業(yè)有限公司，333300，江西，景德鎮(zhèn))

0 引言

我國多目標(biāo)區(qū)域地球化學(xué)調(diào)查項(xiàng)目已發(fā)現(xiàn)我國局部地區(qū)土壤重金屬污染嚴(yán)重。江西有色金屬礦產(chǎn)豐富，重金屬污染的背景值本來就高，是我國重金屬污染最為集中的地方之一。為遏制新的污染，并對歷史上累積在土壤中的重金屬進(jìn)行有效治理，科學(xué)家努力尋找各種緩解或修復(fù)重金屬污染的技術(shù)，目前利用超高富集重金屬植物緩解和修復(fù)重金屬污染土地成為研究熱點(diǎn)。據(jù)湖南省蠶?？茖W(xué)研究所的研究，桑樹是鎘等重金屬高吸附植物，可作為重金屬污染農(nóng)田耕作改制的重要選擇品種：鎘等重金屬主要沉積在桑樹的根和莖干，而枝葉的沉積量很低，其含量符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB13078-2017)。該分布特點(diǎn)表明，根莖中的重金屬可通過工業(yè)回收利用，不會形成二次污染，對于修復(fù)重金屬污染土地將發(fā)揮重要作用；而桑葉作為畜禽飼料也是安全的。因此，種桑治污、種桑喂畜，可謂一舉兩得，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和環(huán)境效益。

我國科研人員通過人工選擇與雜交育種，培育出的抗逆性品系——飼用桑目前已被廣泛用于豬、牛、羊、雞等動物的飼養(yǎng)。飼料桑是一種產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，飼用價(jià)值大，極具開發(fā)潛力的功能性飼料資源。有研究表明，鮮桑葉干物質(zhì)含量約25%，其干物質(zhì)中的粗蛋白含量可達(dá)16%～30%，與大多數(shù)豆類牧草的蛋白質(zhì)含量相近，且其氨基酸含量較高，種類豐富，可作為一種良好的蛋白質(zhì)飼料。經(jīng)引種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料桑在湖南紅黃壤地區(qū)長勢良好，具有很好的推廣價(jià)值[1]。但利用在污染區(qū)種植飼料桑飼喂牛的報(bào)道較少，亦未見其對肉牛瘤胃的發(fā)酵特性的報(bào)道。李文娟[2]等采用體外產(chǎn)氣法評定了桑葉的飼用價(jià)值，為其作為反芻動物粗糧提供了依據(jù)，本研究采用體外瘤胃發(fā)酵法研究飼料桑粉與牛用全價(jià)精料的瘤胃發(fā)酵特性，為飼料桑粉代替牛用全價(jià)精料的研究開發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)為緩解重金屬污染的同時(shí)，開發(fā)一種蛋白質(zhì)飼料資源，為其在養(yǎng)牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，可為我國反芻動物的飼養(yǎng)節(jié)約成本，對解決“人畜爭糧”矛盾具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其成分測定

飼料桑粉的制備：于種植豐產(chǎn)期采集距離地面1 cm的桑葉(三倍體飼料桑)，將葉片于65℃烘干24 h，在室內(nèi)空氣中回潮24 h，稱重粉碎，過40目篩，置于陰涼處儲存待分析。

干物質(zhì)、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、重金屬含量等常規(guī)樣品成分分析在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行測定，測定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測》第3版的方法[3]。

1.2 試驗(yàn)動物及其飼養(yǎng)管理

選取3頭健康，裝有永久性瘤胃瘺管的成年廣豐黃牛為試驗(yàn)動物，體重350±20 kg，驅(qū)蟲，預(yù)飼期2周，試驗(yàn)日糧精粗比6:4，試驗(yàn)牛的日糧組成(見表1)，每天喂料2次(07:30和16:30)，自由飲水，單槽飼養(yǎng)。試驗(yàn)期于晨飼前采集瘤胃液。

表1 試驗(yàn)動物日糧組成

注：每千克預(yù)混料含維生素 A50 萬、維生素 D38萬和維生素E2000 IU、煙酸 80、Cu2、Fe10、Mn8、Zn6、Se0.02、I0.1和Co0.02 g。

1.3 試驗(yàn)方法

體外法測定飼料桑粉與牛用全價(jià)精料的瘤胃液發(fā)酵特性。試驗(yàn)設(shè)1個(gè)空白組(編號為CK)和2個(gè)試驗(yàn)組，每組12個(gè)重復(fù)。對照組不添加底物，試驗(yàn)1組以2 g飼料桑粉為底物，編號為ST；試驗(yàn)2組以2 g牛用全價(jià)精料為底物，編號為JT。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

本試驗(yàn)方法采用Mauricio[4]等的壓力讀取式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)。厭氧人工瘤胃緩沖液的配制按Menke[5]等的方法配制。

在試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前抽取3頭瘺管牛的瘤胃液放入保溫瓶內(nèi)并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，以防止微生物區(qū)系發(fā)生改變。正式試驗(yàn)前將瘤胃液混合均勻后經(jīng)4層紗布過濾，量取所需體積(瘤胃液與人工瘤胃營養(yǎng)液的體積比為1:2)的瘤胃液迅速加入到準(zhǔn)備好的人工瘤胃液營養(yǎng)液中，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液。混合人工瘤胃培養(yǎng)液通入無氧CO2，同時(shí)邊加熱邊用磁力攪拌器攪拌，調(diào)節(jié)pH至6.9～7.0后，39℃水浴30 min。水浴完成后，用手動分液器向每個(gè)已準(zhǔn)備好底物的培養(yǎng)瓶中分別加入50 mL上述培養(yǎng)液，通無氧CO2排盡培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣后迅速蓋好蓋子并密封?；靹蚺囵B(yǎng)瓶中底物，置于39℃恒溫培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)，記錄起始時(shí)間。整個(gè)操作過程應(yīng)保證在厭氧條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，取出培養(yǎng)瓶，用壓力讀取器快速讀取瓶內(nèi)壓力并記錄。讀數(shù)后及時(shí)排氣至培養(yǎng)瓶壓力為0。

1.4 培養(yǎng)終止并取樣

在體外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h和24 h時(shí)，在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理包括空白組各拿出6個(gè)培養(yǎng)瓶快速放入冰水浴中停止發(fā)酵。中止發(fā)酵后將培養(yǎng)瓶拿出恢復(fù)到室溫后用pH計(jì)測定發(fā)酵液pH值。每個(gè)點(diǎn)取3瓶用來測干物質(zhì)消失率，另3瓶取發(fā)酵液經(jīng)低溫離心(4℃、8 000 g、15 min)，取上清液冷凍保存以備測其它發(fā)酵參數(shù)(BCP、VFA、NH3-N)的測定。

1.5 發(fā)酵參數(shù)測定

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量測定參照Mauricio[4]等方法。當(dāng)培養(yǎng)至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，取出培養(yǎng)瓶，用壓力讀取器快速讀取瓶內(nèi)壓力并記錄。讀數(shù)后及時(shí)排氣至培養(yǎng)瓶壓力為0。

產(chǎn)氣量計(jì)算公式：

式中：GPt為樣品在t時(shí)間段的產(chǎn)氣量(mL)；Pt為t時(shí)間段讀取的壓力(kPa)；V0為瓶子體積；101.3為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(kPa)；W為樣品干物質(zhì)重。產(chǎn)氣過程的總積累產(chǎn)氣量為各時(shí)間段產(chǎn)氣量之和。

發(fā)酵液的pH值直接由pH計(jì)測定。

培養(yǎng)液用紗布過濾，濾渣無損失地轉(zhuǎn)移入100 mL大坩堝中，65℃烘干，測定干物質(zhì)降解率。干物質(zhì)消化率(DM，%)=(樣本DM重-殘?jiān)麯M重+空白管DM重)/樣本DM重×100。

菌體粗蛋白(BCP)含量測定參照Zinn[6]等分步離心法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，取經(jīng)預(yù)處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液10 mL，以16 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀的細(xì)菌部分加以9 mL、10%三氯乙酸溶液，混勻，再以4 000 r/min離心10 min，取沉淀物加少量5%氫氧化鈉溶解后稀釋至25 mL。此稀釋液又經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液在紫外分光光度計(jì)上用280 nm和260 nm波長進(jìn)行比色。細(xì)菌蛋白含量計(jì)算公式如下：

細(xì)菌蛋白質(zhì)含量(mg/mL)=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數(shù)。

氨態(tài)氮(NH3-N)測定參照馮宗慈等的比色法進(jìn)行測定[7]。

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測定參照秦為琳的方法[8]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL2003整理，運(yùn)用SPSS18統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著則用DUNCAN法進(jìn)行多重比較。當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料桑粉營養(yǎng)成分分析

由表3可看出，飼料桑粉的干物質(zhì)為91.38%、粗蛋白質(zhì)18.29%、粗脂肪1.32%、粗纖維21.4%、鈣2.33%、總磷0.16%、粗灰分13.84%和總能為15.85 MJ/kg。其中干物質(zhì)含量、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣均比相同質(zhì)量的牛用全價(jià)精料中含量高，二者的總能則基本無差異。由此可知，飼料桑綜合營養(yǎng)比牛用全價(jià)精料要高。

表3 飼料桑營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.2 飼料桑粉安全性評價(jià)

從表4可以看出，飼料桑粉中鉻含量為4.32 mg/kg，鎘含量為0.40 mg/kg，均在國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB13078-2017規(guī)定范圍內(nèi)，說明供試飼料桑粉作為飼料是安全的。

表4 飼料桑粉安全性評價(jià)指標(biāo))

2.3 飼料桑粉和牛用全價(jià)精料對體外培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)氣量、pH、菌體蛋白及氨態(tài)氮指標(biāo)的影響

ST組(飼料桑)在發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)2 h、4 h、12 h時(shí)產(chǎn)氣量均顯著高于JT組(牛用復(fù)合精料)的產(chǎn)氣量(表5)，但是時(shí)間點(diǎn)8 h、24 h時(shí)ST的產(chǎn)氣量略低于JT組，但無顯著差異；ST組在0-8 h為產(chǎn)氣量上升最快的時(shí)間段，8 h之后產(chǎn)氣量增長速度減慢，12-24 h趨于平緩；JT組在0-2 h產(chǎn)氣量較少，2-8 h為產(chǎn)氣量上升最快的時(shí)間段，8 h之后產(chǎn)氣量增長速度減慢，12-24 h趨于平緩。而飼料桑的12 h、24 h的累計(jì)產(chǎn)氣量均顯著高于牛用全價(jià)精料產(chǎn)氣量(P<0.000 1)。

表5 飼料桑粉和牛用全價(jià)精料體外瘤胃發(fā)酵情況

項(xiàng)目時(shí)間/h不同處理組STJTP產(chǎn)氣量/mL217.77±8.39a9.87±0.71b<0.01426.49±0.91a17.89±0.90b<0.01838.94±0.9839.13±0.190.571221.22±0.50a18.60±0.56b0.012413.08±0.3714.35±0.620.1612 hT12 h累積產(chǎn)氣量104.02±1.76a85.50±1.14b<0.0124 hT24h累積產(chǎn)氣量115.06±0.52a97.96±0.39b<0.01pH125.55±0.01a4.78±0.02b<0.01245.41±0.01a4.63±0.01b<0.011干物質(zhì)消失率/%1254.08±0.72b61.93±0.58a0.042456.30±0.26b62.97±0.12a0.01菌體蛋白/mg·mL-1123.55±0.03a1.91±0.04b<0.01243.08±0.232.51±0.170.12氨態(tài)氮/mg·dl-11211.54±0.60a3.88±0.30b<0.012416.16±0.92a6.57±0.33b0.01

從表5可以看出，ST組與JT組的發(fā)酵液的pH在12 h、24 h均存在顯著差異，即ST組的pH顯著高于JT組。ST組發(fā)酵液的pH在12 h、24 h時(shí)為5.55±0.01、5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范圍5.5～7.5，而JT組發(fā)酵液的pH在12 h、24 h時(shí)為4.78±0.02、4.63±0.01，則顯著降低了發(fā)酵液的pH值，說明飼料桑粉對瘤胃液pH值波動負(fù)面影響較牛用全價(jià)精料顯著偏低。

ST組的干物質(zhì)消失率在12 h、24 h時(shí)均顯著低于JT組的干物質(zhì)消失率，這應(yīng)該是與飼料桑粗纖維含量顯著高于牛用全價(jià)精料之故。

ST組在發(fā)酵12 h時(shí)，發(fā)酵液菌體蛋白含量顯著高于JT組發(fā)酵液中的含量；而到發(fā)酵24 h時(shí)，其菌體蛋白含量稍高于JT組發(fā)酵液中的含量，但不存在顯著性差異。

ST組發(fā)酵液中氨態(tài)氮含量則在12 h、24 h時(shí)均顯著高于JT組發(fā)酵液中的氨態(tài)氮含量。

2.4 飼料桑粉和牛用全價(jià)精料對體外培養(yǎng)發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的影響

從表6中可以看出，發(fā)酵到12 h時(shí)，ST組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸含量在發(fā)酵到12 h時(shí)，略低于JT組發(fā)酵液中的含量，但均無顯著差異；而發(fā)酵到24 h時(shí)，ST組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著低于JT組的含量，乙丙比(乙酸/丙酸)則在發(fā)酵12 h、24 h時(shí)兩者均無顯著差異。ST組在發(fā)酵過程中，乙酸、丙酸、總酸含量在24 h均比12 h時(shí)降低近一半，而丁酸含量則從1.17±0.05增加到4.78±0.57；JT組發(fā)酵液的乙酸、丙酸、總酸含量在24 h時(shí)均比12 h增加近1倍或1倍以上。

表6 飼料桑粉和牛用全價(jià)精料體外瘤胃發(fā)酵情況

項(xiàng)目時(shí)間/h不同處理組STJTP乙酸/mmol·L-11263.69±3.8080.80±14.880.332436.94±3.18b146.50±1.08a<0.01丙酸/mmol·L-11222.79±1.5926.49±1.340.1512412.46±0.53b51.96±1.48a<0.01丁酸/mmol·L-1121.17±0.051.67±0.270.14244.78±0.57b16.48±1.61a0.00總揮發(fā)性脂肪酸TVFA/mmol·L-11287.64±4.89108.96±15.530.262454.18±2.32b214.94±1.69a<0.01乙酸/丙酸122.81±0.163.03±0.500.69242.99±0.372.82±0.080.68

3 討論

3.1 飼料桑的營養(yǎng)成分及安全評價(jià)

已有調(diào)查研究表明，在不同地區(qū)、不同生長季節(jié)、不同品種、不同種植方式等條件下的桑葉營養(yǎng)成分差異較大。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，桑葉中粗蛋白含量 16%～30% ，粗纖維 8%～12%，粗脂肪4%～10% ，灰分 8%～12% ，磷0.3%～0.6%，鈣 1%～3%。桑葉中還含有非特異性抗菌成分，能提高機(jī)體免疫能力、抗菌等作用[10]，桑葉作為飼料也無抗藥性，能激發(fā)機(jī)體抗病因子，不引發(fā)病菌變異，故桑葉飼料能增強(qiáng)動物機(jī)體新陳代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)和酶的合成，促進(jìn)動物體生長，提高繁殖力和生產(chǎn)性能。本研究采用的原料為在重金屬污染土地上種植的飼料桑桑葉。粗蛋白含量偏低，粗纖維含量則明顯偏高，有可能與桑葉采摘時(shí)間，長在特殊土壤等相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究分析。盡管該飼料桑種植在重金屬污染的土壤上，其桑葉的重金屬含量符合飼料原料標(biāo)準(zhǔn)?？梢姡暳仙Ｔ谥挝?、喂畜上發(fā)揮其作用，并在一定程度上緩解人畜爭糧的矛盾。

3.2 飼料桑和牛用全價(jià)精料體外瘤胃發(fā)酵特性

產(chǎn)氣量是衡量飼草營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，是一個(gè)綜合反映飼料中有機(jī)物可發(fā)酵程度的指標(biāo)，體外發(fā)酵產(chǎn)氣量則反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，與飼料中碳水化合物消化率高低有關(guān)，是評價(jià)反芻動物瘤胃發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中兩種飼料樣品體外發(fā)酵產(chǎn)氣量動態(tài)變化曲線表明，飼料桑的初始產(chǎn)氣速度較快，而牛用全價(jià)精料初始階段可能因發(fā)酵不完全，產(chǎn)氣量相對較少，之后產(chǎn)氣速度加快，超過一定時(shí)間后產(chǎn)氣速度又逐漸下降，到24 h時(shí)，產(chǎn)氣速度趨于平穩(wěn)。本試驗(yàn)中，飼料桑在發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)2 h、4 h、12 h時(shí)產(chǎn)氣量均顯著高于牛用復(fù)合精料的產(chǎn)氣量，其在12 h、24 h的累計(jì)產(chǎn)氣量也均顯著高于牛用全價(jià)精料產(chǎn)氣量，有研究表明[10]非纖維性碳水化合物含量與發(fā)酵速度呈正相關(guān)的結(jié)論，有可能是飼料桑中的非纖維性碳水化合物含量比牛用全價(jià)精料中的要高。本研究中飼料桑葉比牛用全價(jià)精料的產(chǎn)氣量顯著提高，說明飼料桑更易于發(fā)酵，與張桂杰[12]等研究的不同發(fā)育期的豆科牧草有相似的產(chǎn)氣性能，從這個(gè)角度講，飼料桑的飼用價(jià)值比牛用全價(jià)精料要高。

pH是反映瘤胃穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。日糧的結(jié)構(gòu)是影響 pH 的主要因素，過高或過低對瘤胃微生物的生長、發(fā)育和發(fā)酵都會產(chǎn)生影響[13]，正常瘤胃液pH范圍5.5～7.5。pH 越低，說明發(fā)酵所產(chǎn)的酸累積得越多。本試驗(yàn)中,飼料桑發(fā)酵液的pH在12 h、24 h時(shí)為5.55±0.01，5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范圍5.5～7.5，顯著高于牛用全價(jià)精的4.78±0.02，4.63±0.01，可見，飼料桑對瘤胃液pH值影響要比牛用全價(jià)精料小很多。

體外干物質(zhì)消化率反映了評價(jià)飼料消化的難易程度[14]，與飼料中NDF和ADF的含量有關(guān)。文亦芾[15-16]等的研究結(jié)果表明體外干物質(zhì)消化率與NDF和ADF的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。靳玲品[17]的研究則表明，干物質(zhì)消化率與粗蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)中飼料桑葉和牛用全價(jià)精料的消化率都很高，在發(fā)酵12 h和24 h后分別為54.08%、61.93%和56.30%、62.97%。飼料桑葉的干物質(zhì)消化率在發(fā)酵12 h和24 h時(shí)均顯著低于牛用全價(jià)精料的消化率，應(yīng)該是與飼料桑中較高的粗纖維和粗蛋白含量相關(guān)。

Owens[18]等認(rèn)為，瘤胃微生物菌體蛋白合成水平受氨態(tài)氮含量的限制，且需要VFA提供能量，在一定范圍內(nèi)，瘤胃內(nèi)的能氮比例合適時(shí)，微生物菌體蛋白的合成效率最大。本試驗(yàn)中，飼料桑的菌體蛋白在12 h、24 h時(shí)均高于牛用全價(jià)精料，在12 h時(shí)兩者差異顯著，表明添加飼料桑的發(fā)酵液中微生物活性比添加牛用全價(jià)精料大，即飼喂飼料桑后，瘤胃微生物合成菌體蛋白的能力高于飼喂牛用全價(jià)精料。氨態(tài)氮濃度也是評價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)[19]，其反映了蛋白質(zhì)合成與降解所達(dá)到的平衡狀況[20]。本試驗(yàn)在發(fā)酵12 h時(shí)，飼料桑和牛用全價(jià)精料的NH3-N濃度分別為11.54 mg/dl，3.88 mg/dl；24 h時(shí)，分別為16.16 mg/dl和6.57 mg/dl，在12 h和24 h時(shí)，飼料桑的NH3-N濃度均顯著高于牛用全價(jià)精料的NH3-N濃度。

VFA的總產(chǎn)量等可顯著影響反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，是反芻動物主要的能量來源[21]。本試驗(yàn)中，產(chǎn)氣量較高的飼料桑粉的總揮發(fā)性脂肪酸濃度在12 h卻比牛用全價(jià)精料低，在24 h時(shí)則顯著低于牛用全精料的總揮發(fā)性脂肪酸濃度， 這與張?jiān)獞c[22]等的研究結(jié)果不一致；也有研究表明乙酸/丙酸值的大小與能量利用效率成線性相關(guān)[23]，本試驗(yàn)中發(fā)酵到12 h時(shí)，飼料桑的該比值略低于牛用全價(jià)精料比值；但在24 h時(shí)，飼料桑的該比值略高于牛用全價(jià)精料比值，但都無顯著差異，說明二者能量利用效率無差異。

4 結(jié)論

與牛用全價(jià)精料相比，飼料桑葉具有較高的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量、相對容易發(fā)酵且發(fā)酵過程中微生物蛋白質(zhì)合成率高，pH和氨態(tài)氮水平也更符合反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境。綜上可以初步得出結(jié)論：飼料桑葉具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，可以作為反芻動物的精飼料用于日糧中，但其最適添加比例有待進(jìn)一步研究探討。