瓜蔞滴丸的化學(xué)指紋特征及4種成分的定量分析

洪國(guó)君，鄒純才，鄢海燕，王莉麗，呂文雅

瓜蔞用于胸癖癥的治療始見(jiàn)于漢代名醫(yī)張仲景所著的《金匱要略》[1]。瓜蔞滴丸是在瓜蔞片(國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020173)劑型的基礎(chǔ)上[2]，經(jīng)提取溶劑和瓜蔞皮、子配比優(yōu)化等，制備瓜蔞提取物[3]，進(jìn)一步添加聚乙二醇輔料制備而成，用于冠心病、心絞痛等預(yù)防與治療。本研究采用HPLC-PDAD法建立10批瓜蔞滴丸[4]的化學(xué)指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(國(guó)家藥典委員會(huì)，2012.130723版本)計(jì)算瓜蔞滴丸的相似度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定瓜蔞滴丸中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷的含量[5]，以期為瓜蔞滴丸的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 島津LC-20A型高效液相色譜儀(含GDU 20A真空在線(xiàn)脫氣機(jī)，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱溫箱，SPD-M20 A檢測(cè)器)，AUW-220D型電子天平(日本島津公司)，UV2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)，DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒一科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 瓜蔞滴丸(課題組自制，規(guī)格25 mg/丸，每丸相當(dāng)于原瓜蔞生藥0.167 g，批號(hào)20170701～20170710);尿嘧啶(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥98%，批號(hào)20150417)，次黃嘌呤(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥98%，批號(hào)20140928);鳥(niǎo)苷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥98%，批號(hào)20140522)，腺苷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥98%，批號(hào) 20150528)，甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備 (1)對(duì)照品溶液制備：取尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷對(duì)照品，于硅膠干燥器中干燥12 h。分別取適量，精密稱(chēng)定，加15%甲醇制得質(zhì)量濃度分別為66.6、31.25、133.3、200 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。(2)瓜蔞滴丸供試品溶液制備：取瓜蔞滴丸適量，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，加15%甲醇定容至刻度，制得75 mg/mL供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，備用。

1.3.2 色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，I.D.S-5 μm)，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫：0～30 min，甲醇0%；30～50 min，甲醇0%～2%；50～80 min，甲醇2%～6%；80～200 min，甲醇6%～15%；200～250 min，甲醇15%～15%?？偭魉伲?.0 mL/min；柱溫：25 ℃；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm 。

1.3.3 瓜蔞滴丸指紋特征研究 瓜蔞滴丸及對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，設(shè)置1號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正，Mark峰及全譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，得到共有峰的數(shù)目為29個(gè)。其中2、5、13、19號(hào)峰分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷。計(jì)算10批瓜蔞滴丸的指紋圖譜與共有模式的相似度。

1.3.4 瓜蔞滴丸的定量分析

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 精密吸取混合對(duì)照品溶液，稀釋1、2、4、8倍，按“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

1.3.4.2 精密度考察 取瓜蔞滴丸(批號(hào)20170701)適量，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次。尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.55%、2.24%、2.32%、1.49%，表明儀器精密度良好[6]。

1.3.4.3 穩(wěn)定性考察 取瓜蔞滴丸(批號(hào)為20170701)適量，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、6、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定。尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷峰面積的RSD分別為1.22%、0.89%、1.18%、4.23%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4.4 重復(fù)性考察 取同批瓜蔞滴丸6份，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷平均含量的RSD分別為3.55%、1.56%、0.95%、1.85%，表明方法重復(fù)性良好。

1.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷含量的瓜蔞滴丸(批號(hào)為20170701)供試品溶液9份(每份10 mL)，分為3組，每組3份，每份1 mL，每組分別按尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷已知含量的80%、100%、120%精密加入對(duì)照品。按“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷平均含量的RSD分別為3.17%、4.44%、4.15%、3.32%，滿(mǎn)足分析要求(見(jiàn)表2)。

2 結(jié)果

計(jì)算10批瓜蔞滴丸的指紋圖譜與共有模式的相似度，結(jié)果顯示，10批瓜蔞滴丸的相似度為0.99±0.01(Mark峰匹配)和0.97±0.02(全譜峰匹配)(見(jiàn)圖2)。瓜蔞滴丸中4種成分的定量分析結(jié)果顯示，尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷的含量分別為(0.25±2.66)%、(0.15±4.98)%、(0.38±2.51)%、(0.61±1.86)%。

表2 瓜蔞滴丸中4種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

對(duì)照品樣品中量/μg加入量/μg測(cè)得量/μg回收率/%平均 回收率/%RSD/%36.6481.7398.145.8093.55104.2腺苷45.8045.8091.3399.4101.23.3245.8092.59102.154.9699.5597.854.9699.0096.854.96102.32102.8

3 討論

瓜蔞滴丸為瓜蔞的水提醇沉濃縮物加聚乙二醇4000、6000制備的滴丸制劑。從瓜蔞分離得到的皂苷類(lèi)物質(zhì)幾乎全為新化合物，具有抑制炎癥、抗腫瘤等活性[7],瓜蔞中含有的腺苷也被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗血小板聚集活性[8]，且有紫外吸收[9-10]，為此本研究采用HPLC-PDAD技術(shù)對(duì)瓜蔞滴丸的化學(xué)指紋特征及4種核苷類(lèi)成分進(jìn)行定量分析。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，考察了YMS-C18、ZorbaxC18、XB-CN等色譜柱，并對(duì)流動(dòng)相甲醇、乙腈與水、0.1%磷酸水、0.1%醋酸水、0.1%三乙胺水溶液的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YMS-C18色譜柱為固定相，甲醇-水作流動(dòng)相分離效果較好。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同批次的瓜蔞滴丸化學(xué)指紋特征相似度較高，Mark峰和全譜峰匹配的相似度分別為0.99和0.97，故設(shè)定瓜蔞滴丸的化學(xué)指紋特征相似度閾值為0.95。本實(shí)驗(yàn)亦對(duì)瓜蔞滴丸中的尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷等成分進(jìn)行了定量分析方法建立，結(jié)果顯示，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)的RSD最高值分別為2.24%、3.55%、4.23%和4.44%，可滿(mǎn)足定量分析的要求。

綜上，瓜蔞滴丸的化學(xué)指紋特征及4種成分的定量分析，可用于瓜蔞滴丸的質(zhì)量控制。結(jié)合瓜蔞滴丸的化學(xué)指紋特征及4種成分的定量分析及后期的藥效學(xué)研究，可為深入進(jìn)行瓜蔞滴丸的譜效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。