李琳，梁輝，陳俗汝，劉迎佳，王維香

（西華大學食品與生物工程學院,四川 成都 610039）

隨生活水平的不斷提高，人們更加關注食品衛(wèi)生質(zhì)量，愈發(fā)注重飲食安全健康。因此，建立食品相關物質(zhì)的快速毒性評價和致病機理研究平臺顯得尤為重要。

亞硝酸鹽作為良好的防腐劑和發(fā)色劑廣泛應用于肉制品加工中，然而，有研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽急性中毒易致機體缺氧，容易導致肝臟組織的損傷[1,2]。陳永芳[3]通過建立亞硝酸鹽暴露小鼠模型研究了亞硝酸鹽對學習記憶的影響，結(jié)果表明亞硝酸鹽能降低小鼠學習記憶能力，降低程度與亞硝酸鹽濃度呈劑量效應。另有實驗表明：亞硝酸鹽能引起小鼠不孕，或大鼠睪丸毒性[4-6]。斑馬魚Danio rerio 為新興的模式生物，在毒性研究方面與人類基因有87%的相似基因而具有獨特的作用[7]。本實驗以斑馬魚為模式生物，通過研究亞硝酸鹽的急性毒性，觀察亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎發(fā)育的致死、孵化和畸形效應，比較NaNO2和KNO2對斑馬魚胚胎的毒害效應，以期為評估亞硝酸鹽的毒性和研究亞硝酸鹽對人體的影響提供食品安全評價基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用野生型斑馬魚雌雄成魚，體形正常，鱗和鰭無損，游動靈活，捕食敏捷。

實驗藥品為NaNO2、KNO2、NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、苯氧乙醇、吖啶橙（成都科龍試劑有限公司，分析純）。

實驗用斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（青島中科海海水處理有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（CB1350，上海皓莊儀器有限公司），SZX10 型OLYMPUS 顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社OLYMPUS CORPORATION）。

1.2 方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng)液配制

分別稱取3.500g 的NaCl、0.050g 的KCl、0.025g的NaHCO3、0.100g 的CaCl2溶解于純凈水中，定容至1L 作為胚胎培養(yǎng)液。

1.2.2 處理液的配制

配制8.0 mg/mL NaNO2母液，將母液用胚胎培養(yǎng)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL 和2.0 mg/mL 的處理溶液；配制10.0 mg/mL KNO2母液，將母液用胚胎培養(yǎng)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL 和3.0 mg/mL 的處理溶液。

1.2.3 胚胎收集和處理

成年斑馬魚飼養(yǎng)在置于14 h∶10 h 的明暗交替系統(tǒng)下的3 升養(yǎng)殖水箱中，水箱中裝有處于循環(huán)系統(tǒng)中脫氯和紫外線消毒的養(yǎng)殖水。養(yǎng)殖水溫度保持在26.0～（28.5±1）℃，電導率保持在500～（750±50）s，酸堿度保持在6.9～（7.5±0.5），溶解氧飽和度等于或高于95%。成魚每天用人工飼料（德國TetraMin）和活的豐年蝦喂養(yǎng)2 次，每周6 天。

實驗前一天，按2∶1 的比例選取健康的性成熟活潑雄、雌斑馬魚放入盛有養(yǎng)殖水的交配盒中，用隔板隔開，遮光處理。第二天將隔板取走，光刺激，雌雄魚追逐開始產(chǎn)卵，記錄產(chǎn)卵時間。30 min 內(nèi)將魚卵挑出、清洗干凈至無異物附著，受精后5～6hpf（hours post fertilization）在體式顯微鏡下觀察選擇發(fā)育正常的胚胎放入盛有5.0 mL 處理液的6 孔板中，每孔30 個胚胎，置于（28.5±0.5）℃的恒溫培養(yǎng)箱中暴露至96 hpf。期間，每隔24 h，換新鮮處理液。分別在24 hpf、48 hpf、72 hpf 和96 hpf 時觀察記錄胚胎死亡、孵化、畸形情況，以及24 hpf 時測定胚胎5 min 內(nèi)的自主活動次數(shù)，48 hpf 時測胚胎20s 內(nèi)的心跳次數(shù)，72 hpf 時測量孵出仔魚體長。用改良寇式法[8]計算NaNO2和KNO296 hpf 的LC50（導致胚胎死亡50%時的濃度），EC50（導致胚胎致畸50%時的濃度）以及IC50（抑制50%胚胎孵出時的濃度），重復實驗3 次，并用Excel 單因素顯著差異法統(tǒng)計分析對照組和實驗組之間各測定指標結(jié)果的差異性（P＜0.05）。

1.2.4 胚胎細胞凋亡熒光染色

96 hpf 時將六孔板中孵出仔魚用胚胎液洗一次，每孔加入2.5mL 2.0mg/L 吖啶橙染色液，暗處理30min；隨后用胚胎培養(yǎng)液清洗三次，每次靜置5min；加入1.0mL 0.08%苯氧乙醇，麻醉后置熒光顯微鏡下觀察熒光強度并用Image J 軟件分析熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎孵化率、致畸率和致死率的影響

正常胚胎在48 hpf 時開始孵出，72 hpf 內(nèi)全部孵出。由圖1-A 可知，亞硝酸鹽處理組隨處理濃度增大，孵化率下降，并呈劑量效應，表明亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎孵化有抑制作用。用改進寇氏法計算NaNO2和KNO2對斑馬魚胚胎的96 hpf-IC50分別為0.84 mg/mL 和1.04 mg/mL，表明NaNO2對斑馬魚孵化抑制程度強于KNO2。

由圖1-B 可見，經(jīng)NaNO2和KNO2處理后，斑馬魚胚胎均在48 hpf 時開始出現(xiàn)異常，并隨濃度增加和作用時間延長，畸形率增加，呈劑量效應，表明亞硝酸鹽誘導斑馬魚胚胎發(fā)育畸形。NaNO2和KNO2對斑馬魚胚胎的96 hpf-EC50分別為1.12 mg/mL 和1.50 mg/mL，表明NaNO2對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸效應強于KNO2。

圖1 不同亞硝酸鹽對斑馬魚的孵化率（A）、畸形率（B）和死亡率（C，96hpf）的影響Fig.1 Effects of nitrite on hatching rate（A），deformity rate（B）and mortality rate（C,96hpf）of zebrafish

NaNO2和KNO2對斑馬魚胚胎發(fā)育的致死率見圖1-C。由圖1-C 可知：在72hpf 內(nèi)，各個濃度的NaNO2和KNO2處理液對斑馬魚胚胎并無致死性。在96 hpf 時，0.4 mg/mL 和0.8 mg/mL NaNO2的低濃度處理液的致死率不高，分別為2.23%和4.43%；1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0mg/mL NaNO2處理液的致死率分別為28.00%、41.33%以及81.67%。0.5 mg/mL 和1.0 mg/mL KNO2處理液在低濃度的致死率較低，兩者均為4.44%，在1.5 mg/mL 時致死率開始迅速上升，死亡率為8.89%，2.0 mg/mL、3.0 mg/mL處理液的致死率分別為22.22%、53.33%。亞硝酸鹽處理導致斑馬魚胚胎死亡且致死率與亞硝酸鹽濃度呈劑量效應。NaNO2和KNO2對斑馬魚胚胎的96 hpf-LC50分別為1.30mg/mL 和1.44 mg/mL，表明NaNO2對斑馬魚胚胎發(fā)育的致死性大于KNO2。

2.2 不同亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎自主活動、心率、體長的影響

由圖2-A 可知，在不同濃度亞硝酸鹽處理液下，斑馬魚自主活動受到抑制。隨著處理液濃度的增加，抑制作用也逐漸增強，且在0.5 mg/mL 和1.0mg/mL KNO2時有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同亞硝酸鹽對斑馬魚自主活動次數(shù)（24hpf）（A）、心率（48hpf）（B）以及體長（72hpf）（C）的影響Fig.2 Effect of nitrite on the number of independent activities（24hpf）（A）、heart-beating rate （48hpf）（B）and body length（72hpf）（C）of zebrafish

由圖2-B 可知，48hpf 時空白組的胚胎每20s內(nèi)心跳45 次，隨著NaNO2濃度增大，斑馬魚胚胎心率逐漸降低，2.0mg/mL 時差異顯著，各KNO2溶液濃度對斑馬魚心率的影響較小。

由圖2-C 可知，在72hpf 時的斑馬魚仔魚平均體長為3400.00μm。隨著NaNO2、KNO2濃度增加體長減小，但兩者對斑馬魚仔魚體長的影響無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同亞硝酸鹽導致斑馬魚胚胎畸形

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖3-B 和3-C），NaNO2和KNO2處理斑馬魚均存在心包水腫、脊柱彎曲、頭部卵黃不同程度發(fā)黑等畸形現(xiàn)象，且以頭部發(fā)黑為主，其次是脊柱彎曲，最后是心包水腫，部分胚胎發(fā)育遲緩且伴隨著一定程度的頭部發(fā)黑與心包水腫，表明NaNO2和KNO2對斑馬魚的毒害機理相似。96hpf 時，2.0 mg/mL NaNO2處理導致斑馬魚頭部發(fā)黑、脊柱彎曲、心包水腫的畸形各占比分別為90.00%、87.78%和33.33%，而3.0mg/mL KNO2處理導致畸形各占比分別為50.00%、53.33%和18.89%（圖3-D），表明NaNO2對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸性更嚴重。

2.4 亞硝酸鹽誘導斑馬魚胚胎細胞死亡

圖3 不同亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎形態(tài)發(fā)育致畸的影響Fig.3 Effect of nitrite on morphological developmental deformity of zebrafish embryos

圖4 NaNO2 處理導致斑馬魚胚胎死亡Fig.4 Effect of NaNO2 on cell death of zebrafish embryos

吖啶橙熒光染色可以反映細胞死亡情況[9]。由圖4-A 可知，對照組斑馬魚的頭部、卵黃囊有較淺的綠色，說明在正常生長過程中有少許細胞凋亡，且主要集中在頭部、卵黃部。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，斑馬魚頭部和卵黃熒光色增加，在1.6mg/mL和2.0mg/mL NaNO2下，頭部、卵黃部熒光色最明顯。隨處理液中亞硝酸鹽濃度增加，死亡細胞數(shù)增多，脊柱也出現(xiàn)不同程度的熒光色，表明脊柱已受到毒害作用，且毒害作用與NaNO2濃度呈劑量效應。用Image J 軟件進行熒光強度分析顯示（圖4-B），NaNO2濃度在1.6mg/mL 和2.0mg/mL 時差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

斑馬魚是研究脊椎動物發(fā)育的理想模型。其易發(fā)生基因突變，體表形態(tài)上會有明顯的變化，這為研究基因組、蛋白質(zhì)組學提供了很好的實驗材料。在毒理學研究和污染控制中，它用于各類標準化的化學品和排放物的急、慢性毒性試驗[10]。亞硝酸鹽在肉制品、腌制品等中普遍應用，研究亞硝酸鹽對人體、動物、環(huán)境的毒害作用有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽對斑馬魚生長的毒害主要表現(xiàn)為自主活動和心跳次數(shù)減少、體長變短、心包水腫、脊柱彎曲、卵黃異常、頭部發(fā)黑等，這與Simmons 等[11]的研究結(jié)果一致，同時與龍虎斑（Epinephelus lanceolatus×E.fuscoguttatus）、大刺鰍Mastacembelus aculeatus 幼魚的中毒癥狀相似。兩者暴露在亞硝酸鹽環(huán)境中均體色加深、鰓絲呈棕色、魚體失去平衡側(cè)躺，最終死亡[12,13]。NaNO2暴露能降低斑馬魚心跳次數(shù)，說明其對斑馬魚的心臟發(fā)育有一定毒害作用。李俊博等[14]研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽以濃度依賴的方式致斑馬魚瓣膜發(fā)育的毒性效應，胚胎心臟水腫等發(fā)育異常,其作用的時間自36hpf 起。從48hpf 開始，過量的亞硝酸鹽影響房室通道處的心內(nèi)膜墊發(fā)生,導致在76hpf 時斑馬魚的瓣膜發(fā)育明顯缺失。實驗測得72hpf 時亞硝酸鹽處理的斑馬魚仔魚體長短于對照組，表明亞硝酸鹽抑制斑馬魚生長。Vosláová 等[15]采用OECD 215 幼魚生長試驗，通過亞致死劑量研究NO2-對斑馬魚生長的影響，其結(jié)果表明，NO2-抑制斑馬魚幼魚生長。

本研究用改良寇氏法計算得NaNO2對斑馬魚胚胎的96hpf-LC50為1.30mg/mL，KNO2的96hpf-LC50為1.44 mg/mL，而Simmons 等[11]研究得到96hpf-LC50為0.41 g/mL。Petra 等[16]測得NO2-對斑馬魚96hpf-LC50為0.24mg/mL。本研究的LC50明顯高于已報道文獻，原因可能是受毒時間不同，Simmons等[11]的實驗受毒時間是24h 開始，胚胎越早接觸處理液，可能會產(chǎn)生抵抗性，敏感性會降低。曹伏君等[12]和樊海平等[13]分別對龍虎斑、大刺鰍幼魚進行了亞硝酸鹽急性毒性作用的研究。結(jié)果表明亞硝酸鹽對龍虎斑和大刺鰍幼魚的96hLC50分別為90.41mg/L 和0.789mg/L。與斑馬魚相比，龍虎斑和大刺鰍幼魚比較敏感，容易受到亞硝酸鹽的毒害。童雅琛等[17]發(fā)現(xiàn)，低濃度（2.0mol/L）的亞硝酸鹽會造成家兔心率加快，高濃度（5.0 mol/L 和7.0 mol/L）下，心率出現(xiàn)明顯下降。大鼠經(jīng)1.0mL 的2%或4%的NaNO2溶液投服后，即可引起中毒死亡[18]。Til等[19]研究大鼠接受不同濃度KNO2的飲用水的毒性作用，觀察到劑量相關的腎上腺帶狀腎小球肥大，對大鼠的無作用劑量低于100 mg/L。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)準則》，對于奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒，其接觸亞硝酸鹽主要的外部來源就是飲用水，以嬰兒免得高鐵血紅蛋白癥的亞硝酸鹽準則值為3.0mg/L（以NO2-計）[20]。尚未見有關于KNO2對斑馬魚的毒害作用的報道，本研究豐富了相關資料,具有一定借鑒意義。亞硝酸鹽對斑馬魚胚胎及幼魚的毒性特征與傳統(tǒng)動物模型的毒性特征相似，且毒性實驗簡單易操作，斑馬魚可以替代傳統(tǒng)動物模型用于食品安全檢測。