酮咯酸氨丁三醇抑制核轉(zhuǎn)錄因子對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷修復(fù)及血管新生的調(diào)節(jié)作用

江 濤，馮程程，張明月，余天美，張 天

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是臨床常見的退行性關(guān)節(jié)病，以膝關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣?，?yán)重者會出現(xiàn)畸形及活動受限等癥狀，給患者的正常生活及工作造成巨大影響[1]?？寡准版?zhèn)痛藥物是治療KOA最常用的方式，但這種治療只能減輕患者的疼痛程度，并不能阻止或減緩疾病的進(jìn)展程度[2]。目前，臨床治療KOA的方式很多，以保守治療為主，常用藥物治療，而藥物又以非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)為首選[3]。透明質(zhì)酸、類固醇等也是臨床治療KOA的常用藥物，可有效緩解疼痛，但是易引發(fā)關(guān)節(jié)感染、關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械損傷等不良事件，療效有限[4]。酮咯酸氨丁三醇是一種新型NSAIDs，既往研究證實其對KOA的鎮(zhèn)痛效果顯著，且具有較高的安全性，但其能否發(fā)揮修復(fù)KOA患者軟骨損傷及調(diào)節(jié)血管新生的作用尚不得而知[5]?；诖?，本研究建立KOA大鼠模型后，分別予以不同劑量酮咯酸氨丁三醇干預(yù)，通過對比分析酮咯酸氨丁三醇對KOA大鼠軟骨損傷修復(fù)及血管新生的調(diào)節(jié)作用，并探討相應(yīng)的機(jī)制，旨在為酮咯酸氨丁三醇治療KOA提供理論參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：健康雄性SD大鼠60只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2017-0022。

1.1.2實驗試劑與儀器：酮咯酸氨丁三醇(山東新時代藥業(yè)有限公司)，氨基葡萄糖(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，DEME細(xì)胞培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)，胰蛋白酶、10%胎牛血清(美國Life Technology公司)，Western blot檢測一抗(美國SANTA CRUZ公司)，辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，自動細(xì)胞計數(shù)儀、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2KOA大鼠模型建造 將所有大鼠置于實驗室環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)后，取10只作為對照組，予以正常喂養(yǎng)，剩余50只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法建立KOA模型，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，雙膝關(guān)節(jié)刮毛消毒后于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作2 cm的縱形切口，打開關(guān)節(jié)腔。將髕骨向外側(cè)推至脫位，使膝關(guān)節(jié)處于最大屈曲狀態(tài)，暴露關(guān)節(jié)腔后切斷右膝前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，避免人為損傷關(guān)節(jié)軟骨面，行抽屜試驗陽性后徹底止血，逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素預(yù)防感染，劑量為4×104U/d，第4天起每天驅(qū)趕動物奔跑30 min，其余時間自由活動。

1.3大鼠分組與給藥 造模4周后將KOA模型大鼠隨機(jī)分為模型組、氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇0.5、1、2 mg/kg組，每組10只，10只未造模的大鼠為對照組。氨基葡萄糖組予以0.098 g/kg氨基葡萄糖灌胃，1/d；酮咯酸氨丁三醇0.5、1、2 mg/kg組分別予以0.5、1、2 mg/kg酮咯酸氨丁三醇灌胃，1/d；模型組及對照組均予以等體積生理鹽水灌胃，1/d。所有大鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.4樣本采集 給藥結(jié)束后，取大鼠主動脈血1～2 ml，經(jīng)離心分離血清。隨后斷頸處死大鼠，分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織及滑膜組織，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1組織病理學(xué)分析：取各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用多聚甲醛固定后制作厚度為4 μm的組織切片，進(jìn)行番紅O快綠染色，風(fēng)干后采用光學(xué)顯微鏡觀察軟骨組織形態(tài)并拍照。

1.5.2血清學(xué)指標(biāo)檢測：采用ELISA法檢測各組大鼠血清白介素-17(interleukin-17, IL-17)、IL-23、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)的含量。

1.5.3血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA檢測：收集各組血清、軟骨組織及滑膜組織，采用RT-PCR法分別檢測各組血清、軟骨組織及滑膜組織VEGF mRNA表達(dá)情況。采用Trizol試劑提取總RNA，然后用Fermentas公司生產(chǎn)的兩步法RNA提取試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。選擇VEGF的上下游引物，以cDNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增待檢測基因?；虍a(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠檢測，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算各組血清、軟骨組織及滑膜組織中VEGF mRNA相對表達(dá)量。

1.5.4Western blot法檢測蛋白表達(dá)情況：收集各組軟骨組織，提取總蛋白，樣品蛋白通過Bradford法于分光光度計檢測其濃度。每樣品孔上樣40 μg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉(50 g/L)室溫封閉2 h，分別加入Survivin、VEGF、蛋白聚糖(Aggrecan)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)、Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB, NF-κB)、IκB-α和IκB-β一抗，4℃過夜，用TBST洗膜10 min，共5次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，用TBST洗膜10 min，共5次，ECL顯影劑顯影，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。計算Survivin、VEGF、Aggrecan、MMP-13、Col Ⅱ、NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1軟骨組織的病理改變及Survivin蛋白表達(dá) 番紅O快綠染色圖片顯示，對照組軟骨組織關(guān)節(jié)面光滑，無Aggrecan丟失，保持正常關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)；模型組軟骨組織透明軟骨層變薄且呈現(xiàn)纖維化，關(guān)節(jié)軟骨面大量Aggrecan丟失、出現(xiàn)軟骨退變，部分甚至出現(xiàn)軟骨剝脫。與模型組比較，氨基葡萄糖組軟骨組織Aggrecan量明顯增加，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)基本保持正常。不同濃度酮咯酸氨丁三醇組，隨著酮咯酸氨丁三醇濃度增加，大鼠軟骨組織Aggrecan量逐漸增加，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)也逐漸恢復(fù)正常。見圖1。與對照組比較，模型組軟骨組織Survivin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg組軟骨組織Survivin蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與氨基葡萄糖組比較，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg組軟骨組織Survivin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組與氨基葡萄糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 6組大鼠軟骨組織病理改變(番紅O快綠染色 ×200)

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組

圖2 6組大鼠軟骨組織Survivin蛋白印跡圖和相對表達(dá)量

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組；KOA為膝骨關(guān)節(jié)炎；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與氨基葡萄糖組比較，eP<0.05

2.2軟骨標(biāo)記蛋白表達(dá)情況 與對照組比較，模型組軟骨組織Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相對表達(dá)量明顯降低，而MMP-13蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg組軟骨組織Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相對表達(dá)量明顯升高，而MMP-13蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與氨基葡萄糖組比較，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg組軟骨組織Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相對表達(dá)量明顯降低，而MMP-13蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組Aggrecan、Col Ⅱ、MMP-13蛋白相對表達(dá)量與氨基葡萄糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 6組大鼠軟骨組織Aggrecan、MMP-13、Col Ⅱ蛋白印跡圖和相對表達(dá)量

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組；KOA為膝骨關(guān)節(jié)炎，MMP-13為基質(zhì)金屬蛋白酶-13、Col Ⅱ為Ⅱ型膠原蛋白；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與氨基葡萄糖組比較，eP<0.05

2.3血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白表達(dá)量 與對照組比較，模型組血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg組血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與氨基葡萄糖組比較，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg組血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量與氨基葡萄糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

2.4血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平 與對照組比較，模型組血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg組血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明顯降低(P<0.05)。與氨基葡萄糖組比較，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg組血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明顯升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平與氨基葡萄糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

2.5軟骨組織NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白表達(dá)情況 與對照組比較，模型組軟骨組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量明顯升高，而IκB-α和IκB-β蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，氨基葡萄糖組、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg組軟骨組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量明顯降低，而IκB-α和IκB-β蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與氨基葡萄糖組比較，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg組軟骨組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量明顯升高，而IκB-α和IκB-β蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組軟骨組織NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白相對表達(dá)量與氨基葡萄糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖4 6組大鼠血清、軟骨及滑膜組織VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組；VEGF為血管內(nèi)皮生長因子；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與氨基葡萄糖組比較，eP<0.05

圖5 6組大鼠血清IL-17、IL-23、iNOS及MCP-1水平比較

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組；IL-17為白介素-17，IL-23為白介素-23，iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，MCP-1為單核細(xì)胞趨化蛋白-1；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與氨基葡萄糖組比較，eP<0.05

圖6 6組大鼠軟骨組織NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白印跡圖和相對表達(dá)量

A.對照組；B.模型組；C.氨基葡萄糖組；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg組；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg組；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg組；KOA為膝骨關(guān)節(jié)炎，NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與氨基葡萄糖組比較，eP<0.05

3 討論

既往研究證實，KOA的根本原因在于關(guān)節(jié)軟骨本身的病變，由于機(jī)械性的外傷或炎癥等因素造成的軟骨損傷，導(dǎo)致軟骨成分暴露，進(jìn)而引發(fā)自身的免疫反應(yīng)，造成繼發(fā)性損傷[1]。因此，臨床治療KOA的關(guān)鍵在于保護(hù)軟骨組織并促進(jìn)其修復(fù)[7]。透明質(zhì)酸、類固醇等是臨床常用藥物，雖能改善KOA患者關(guān)節(jié)疼痛，但長期使用會加重軟骨損傷[8-9]。相比較而言，氨基葡萄糖治療KOA不僅可明顯減輕痛感，還能延緩及改變KOA的病理進(jìn)程，發(fā)揮對軟骨組織的保護(hù)作用，全面恢復(fù)受損關(guān)節(jié)的功能[10-11]?；诖?，本研究以氨基葡萄糖為陽性對照，探究酮咯酸氨丁三醇在KOA治療中的應(yīng)用價值。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組軟骨組織出現(xiàn)退變，部分甚至出現(xiàn)軟骨剝脫，說明KOA會造成軟骨組織損傷，與Hillen等[12]研究結(jié)果一致。在予以KOA大鼠氨基葡萄糖干預(yù)后，軟骨損傷得到明顯改善，而隨著酮咯酸氨丁三醇給藥濃度的升高，大鼠軟骨損傷的改善作用與氨基葡萄糖組效果相當(dāng)，提示酮咯酸氨丁三醇也可有效促進(jìn)軟骨損傷的恢復(fù)。軟骨細(xì)胞凋亡被認(rèn)為不同于經(jīng)典的細(xì)胞凋亡，是變異的凋亡，而細(xì)胞凋亡是KOA軟骨損傷的關(guān)鍵過程。Survivin蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，被證實在KOA關(guān)節(jié)局部及血清中均顯著表達(dá)，在KOA的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，而酮咯酸氨丁三醇干預(yù)可明顯提升軟骨組織Survivin蛋白表達(dá)量，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而這可能是酮咯酸氨丁三醇發(fā)揮軟骨組織保護(hù)作用的機(jī)制之一[13]。

細(xì)胞外基質(zhì)主要是由Aggrecan及Col Ⅱ組成，Col Ⅱ分布于軟骨組織中發(fā)揮著吸收及分散壓力的作用，Aggrecan覆蓋于膠原纖維的表面，對膠原纖維骨架起著很好的保護(hù)作用，二者共同維持軟骨的生物力學(xué)功能[14]。MMP-13在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，尤其是在Aggrecan及Col Ⅱ的裂解過程中起著至關(guān)重要的作用，可直接裂解Col Ⅱ，破壞軟骨骨架[15-16]。此外，iNOS對Aggrecan有高度的裂解性，在關(guān)節(jié)軟骨機(jī)制降解中起著非常重要的作用，還可激活其他細(xì)胞因子如MMP-13破壞軟骨[17]。本研究結(jié)果顯示，KOA大鼠軟骨組織Aggrecan及Col Ⅱ表達(dá)量明顯降低，而MMP-13表達(dá)量及血清iNOS水平顯著上升，進(jìn)一步證實KOA可造成軟骨組織損傷。而酮咯酸氨丁三醇干預(yù)治療可明顯抑制上述過程，在高濃度下其改善作用與氨基葡萄糖相當(dāng)，證實酮咯酸氨丁三醇能通過抑制MMP-13的表達(dá)及血清iNOS水平，防止軟骨組織中Aggrecan及Col Ⅱ的裂解，進(jìn)而維持軟骨的生物力學(xué)功能，促進(jìn)其損傷修復(fù)。

MCP-1是一種常見的趨化因子，主要由滑膜的成纖維細(xì)胞在炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下合成。在KOA病變關(guān)節(jié)處可產(chǎn)生大量MCP-1，可趨化單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)滑膜組織；另一方面，浸潤于滑膜組織的細(xì)胞在激活狀態(tài)下又可分泌多種包含MCP-1在內(nèi)的趨化因子，他們之間相互作用進(jìn)一步增加炎癥細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜組織中的浸潤及炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，從而使炎癥反應(yīng)反復(fù)發(fā)生，這也是KOA的發(fā)病機(jī)制之一[18]。而酮咯酸氨丁三醇能明顯降低KOA大鼠血清MCP-1及炎性因子IL-17、IL-23的水平，提示酮咯酸氨丁三醇治療KOA能通過降低MCP-1水平來抑制炎性因子的釋放，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)，而這一結(jié)果在宋雪等[5]研究中也得到證實。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的促進(jìn)新生血管形成的特異性因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠血清、軟骨及滑膜組織中VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯上升，VEGF可特異性地與滑膜成纖維樣細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的有絲分裂[19]。此外，VEGF與滑膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，不僅可促進(jìn)血管的生成，還能提升血管通透性，促進(jìn)金屬蛋白酶及間質(zhì)膠原酶的分泌，直接參與軟骨及骨的破壞過程[20]。酮咯酸氨丁三醇可明顯抑制血清、軟骨及滑膜組織中VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)，證實酮咯酸氨丁三醇可通過抑制血清、軟骨及滑膜組織中VEGF水平抑制血管新生，進(jìn)而防止關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)一步發(fā)展。

NF-κB廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中，可調(diào)控靶基因如生長因子、細(xì)胞因子等表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥及血管新生過程[21]。NF-κB的激活因素及其效應(yīng)基因均廣泛分布，眾多的促血管生成因素，如缺氧、IL-17、IL-23等是NF-κB的刺激因素?；罨腘F-κB介導(dǎo)產(chǎn)生促血管生成因子，如VEGF、IL-17、IL-23等，進(jìn)而通過直接及間接的多種途徑，強(qiáng)烈促進(jìn)血管新生[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酮咯酸氨丁三醇可有效抑制NF-κB的產(chǎn)生，實現(xiàn)對IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1等炎性因子表達(dá)的抑制作用，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)，抑制血管新生，促進(jìn)關(guān)節(jié)恢復(fù)。

綜上所述，酮咯酸氨丁三醇可通過抑制NF-κB表達(dá)水平抑制KOA大鼠血管新生，改善關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)其軟骨損傷修復(fù)。