宋梟梟, 周駿馳, 徐 盼, 曹張軍
東華大學(xué)東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620
角蛋白廣泛存在于脊椎動物羽毛,鱗片,爪等部位,具有不溶于水、不易降解、含硫量高等特性[1, 2]。全球每年產(chǎn)生約200萬噸羽毛[3],羽毛中角蛋白含量占90%[4],角蛋白相對分子量約為10 000~36 000[5,6]。角蛋白中含有大量半胱氨酸,分子內(nèi)和分子間形成大量二硫鍵,不會被常見的蛋白水解酶降解[7]。角蛋白具有出色的生物相容性和生物降解性,在蛋白質(zhì)材料方面具有廣闊前景[8]。
研究發(fā)現(xiàn),降解羽毛首先要破壞掉其內(nèi)部的二硫鍵,氫鍵以及疏水作用,將不溶的羽毛變?yōu)榭扇艿慕堑鞍譡5]。目前提取可溶性角蛋白主要通過化學(xué)還原法溶解羽毛[9],這些化學(xué)試劑會破壞角蛋白中的氨基酸組分,形成非營養(yǎng)性氨基酸[10]。利用微生物降解羽毛是一種高效,綠色環(huán)保的降解方法[11],但有關(guān)微生物降解羽毛角蛋白具體機(jī)理尚無定論。曹張軍[12]從腐爛的雞毛中分離出一種羽毛降解菌株,經(jīng)測序鑒定命名為嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(S.maltophiliaDHHJ)。S.maltophiliaDHHJ是一種需氧型,氧化酶陰性,葡萄糖非發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌(GNB),廣泛存在于水、土壤、動植物體內(nèi)[13, 14]。朱茜[15]使用羽毛粉M9培養(yǎng)基培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ,羽毛粉作為氮源,SDS-PAGE電泳檢測到約為10 kDa的角蛋白單體條帶。角蛋白單體是S.maltophiliaDHHJ降解羽毛過程中關(guān)鍵物質(zhì)。
化學(xué)法溶解羽毛制備的水溶性角蛋白培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ,培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量的絮狀沉淀,對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有一定的影響,且提取過程會破壞角蛋白分子中一些氨基酸,影響角蛋白的生物活性。因此,本研究通過構(gòu)建角蛋白表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白單體,用于研究S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)理。
角蛋白基因擴(kuò)增引物由生工生物公司合成,S.maltophiliaDHHJ為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,宿主菌株 BL21(DE3),質(zhì)粒pET32a(+),小鼠抗6×His-tag單克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體購自生工生物公司,NcoⅠ和XhoⅠ購自Takara公司。
1.2.1角蛋白基因擴(kuò)增
在NCBI上查詢到羽毛角蛋白基因(NM_001081702.2)[16],該基因位于雞25號染色體上,全長297 bp,將角蛋白基因插入pET-32a(+)克隆載體,克隆位點(diǎn)為NcoI/XhoI。使用熱激轉(zhuǎn)化法將重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。
(1) 引物設(shè)計(jì)
使用Snap Gene設(shè)計(jì)擴(kuò)增角蛋白基因片段的引物,由生工生物公司合成。上游引物NcoI-Keratin:5′ catgccatggATGTCCTGCTTCGATCTGTG 3′;下游引物Keratin-XhoI:5′ ccgctcgagTTAGCAGGGCAGACACCTCC 3′。
(2) 角蛋白基因擴(kuò)增
將一定量的引物、模板、Taq酶、緩沖液、dNTP以及無菌水加至PCR管中,擴(kuò)增條件如下 :1) 95℃預(yù)變性5 min,2) 95 ℃變性15 s,3) 55 ℃退火15 s,4) 72 ℃延伸15 s,30個(gè)循環(huán),5) 72 ℃總延伸5 min,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳,使用生工生物公司的膠回收試劑盒回收目的片段。
1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
使用NcoI,XhoI快切酶切割角蛋白基因片段與pET32a(+)質(zhì)粒形成互補(bǔ)的黏性末端。酶切反應(yīng)體系(50 μL):10×Fast Digest Buffer 5 μL;Keratin/pET32a(+)質(zhì)粒 40 μL;NcoI 2.5 μL;XhoI 2.5 μL。將上述試劑依次加至離心管中,37 ℃反應(yīng)3 h,酶切后的角蛋白基因片段與質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收酶切產(chǎn)物,使用T4 DNA連接試劑盒,16 ℃過夜反應(yīng),將角蛋白基因連接到pET32a(+)載體中。使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21(DE3)。涂布至含有氨芐青霉素的LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng),挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,同時(shí)將PCR產(chǎn)物送至生工生物進(jìn)行測序鑒定。
1.3.1重組角蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間均會影響重組角蛋白的表達(dá)量。綜合這些因素,先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)探究誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)的最適溫度,最適IPTG濃度和最適誘導(dǎo)時(shí)間。
(1) 最適誘導(dǎo)溫度
使用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組角蛋白表達(dá),分別在37 ℃培養(yǎng)4 h,18 ℃培養(yǎng)17 h,取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE,判斷有無包涵體生成。
(2) IPTG最佳濃度與最佳誘導(dǎo)時(shí)間
分別使用0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L三個(gè)濃度梯度的IPTG,18 ℃,分別培養(yǎng)15 h、17 h和19 h,取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE。
1.3.2重組角蛋白純化與鑒定
(1) 使用上述實(shí)驗(yàn)得出的最適條件誘導(dǎo)重組菌株角蛋白基因表達(dá),5 000 r/min,4 ℃離心20 min收集菌體,使用細(xì)胞破碎儀破碎菌體,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,收集上清液,使用0.45 μm孔徑的過濾器除去上清液中的不溶物。
(2) 使用Ni柱親和層析法純化上清液中的重組角蛋白,使用咪唑濃度為40 mmol/L的洗滌液除去雜蛋白,咪唑濃度為250 mmol/L洗脫液洗脫結(jié)合在Ni柱上的重組角蛋白。將重組角蛋白溶液裝入透析袋置于50 mmol/L的Tris緩沖液(pH=7.8)中,過夜透析,除去咪唑,測定重組角蛋白濃度與產(chǎn)量。
(3) 重組角蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上(恒流300 mA,100 min)。PVDF膜放入封閉液中封閉30 min,棄去封閉液,PBS洗膜2次。加入1∶1 000稀釋的小鼠抗6×His單克隆抗體,4 ℃過夜孵育,使用TBST清洗PVDF膜3次,每次5 min,除去未結(jié)合的一抗。加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體室溫孵育30 min。TBST洗5次,每次5 min,洗去未結(jié)合的二抗。ECL顯影法顯色,凝膠成像儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.4.1重組角蛋白M9培養(yǎng)基中S.maltophiliaDHHJ生長狀況
取1 mL角蛋白M9培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的S.maltophiliaDHHJ菌液,離心(10 000 r/min,2 min)收集菌體,PBS清洗菌體2次,加入2.5%戊二醛固定劑固定4 h; PBS清洗菌體2次,依次使用30%、50%、70%、90%、100%、100%乙醇溶液逐級脫水,每次15 min;叔丁醇置換30 min;烘干,使用無水乙醇重懸菌體,取一滴菌液滴加在鋁箔上,噴金,場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測。
1.4.2角蛋白酶活性測定
角蛋白酶活性測試方法參考郝亞楠[17],取4 mL重組角蛋白M9培養(yǎng)中的S.maltophiliaDHHJ,10 000 r/min,4 ℃離心5 min,收集上清液。稱取10 mg羽毛粉作為底物,加入1 mL上清液,2 mL Tris緩沖液(50 mmol/L,pH=7.8),40 ℃水浴1 h,加入2 mL 10%三氯乙酸溶液4 ℃靜置30 min終止反應(yīng),離心(10 000 r/min,4 ℃,10 min),測定上清液280 nm處的吸光度。每組做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),水浴前加入2 mL 10%三氯乙酸溶液作空白對照組。角蛋白酶活性的定義為280 nm處的吸光值每增加0.1為1 U。
角蛋白基因在NcoI和XhoI兩種快切酶作用下形成黏性末端(圖1a),pET32a(+)載體全長5 900 bp,經(jīng)過NcoI和XhoI酶切后形成與角蛋白基因互補(bǔ)的黏性末端,T4 DNA連接試劑盒將角蛋白基因與載體連接,使用熱激法將重組載體導(dǎo)入BL21(DE3)中得到重組菌株BL21(DE3)-pET32a(+)-Keratin(圖1c)。
a
b
c
圖2a是18 ℃,17 h誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)電泳圖,加入IPTG后出現(xiàn)重組角蛋白,菌體破碎后上清液含有重組角蛋白而沉淀中沒有,證明無包涵體產(chǎn)生,菌體表達(dá)的是可溶性重組角蛋白。圖2b是37 ℃,4 h誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)電泳圖,上清液和沉淀均出現(xiàn)重組角蛋白,誘導(dǎo)過程中形成包涵體,影響重組角蛋白的產(chǎn)量。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用低溫(18 ℃)誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)。
a
b
a: 18 ℃誘導(dǎo)17 h; b: 37 ℃誘導(dǎo)4 h
圖2 重組角蛋白外源表達(dá)
圖3a和b是重組角蛋白IPTG最適誘導(dǎo)條件電泳結(jié)果,誘導(dǎo)溫度為18 ℃,IPTG濃度分別為0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1.0 mmol/L,培養(yǎng)時(shí)間分別為15 h、17 h和19 h。圖3c是對應(yīng)的重組角蛋白灰度值,結(jié)果顯示IPTG濃度是0.5 mmol/L培養(yǎng)15 h和IPTG濃度0.75 mmol/L培養(yǎng)17 h,重組角蛋白表達(dá)量最高。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用IPTG濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)15 h誘導(dǎo)重組角蛋白表達(dá)。
a和b為IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間角蛋白單體產(chǎn)量;c為對應(yīng)條帶灰度值
圖3 IPTG濃度與培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化蛋白表達(dá)量SDS-PAGE檢測
圖4a中,經(jīng)過Ni柱親和層析法純化得到重組角蛋白,蛋白條帶顏色較深,無明顯雜帶,經(jīng)測定重組角蛋白產(chǎn)量約為40 mg/L,濃度約為2 mg/mL。圖4b中,b泳道與c泳道對應(yīng)位置均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,證明純化得到的蛋白就是重組角蛋白。
a: SDS-PAGE;b: Western Blotting
圖4 重組角蛋白純化與Western Blotting鑒定
不同來源的角蛋白M9培養(yǎng)基培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ 24 h后,培養(yǎng)液情況如圖5所示。重組角蛋白培養(yǎng)基與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)的溶液外觀相似(顯現(xiàn)均勻渾濁),細(xì)菌能夠利用重組角蛋白維持正常生理活動,試管中未出現(xiàn)絮狀沉淀。羽毛水解角蛋白在S.maltophiliaDHHJ作用下,試管底部出現(xiàn)大量絮狀沉淀,溶解性較差。
a: 重組角蛋白培養(yǎng)基;b: 羽毛水解角蛋白培養(yǎng)基圖5 S.maltophilia DHHJ在不同培養(yǎng)基中生長狀況
將上述培養(yǎng)的S.maltophiliaDHHJ細(xì)胞固定,電鏡觀察見圖6。由圖6知,試管底部絮狀沉淀是S.maltophiliaDHHJ菌體與析出的角蛋白混合物,角蛋白從培養(yǎng)基中析出包裹在菌體表面沉淀到試管底部,對菌體生長以及生物活性造成一定影響,而重組角蛋白溶解性高于化學(xué)水解角蛋白,培養(yǎng)過程中不會析出,有利于菌體生長,同時(shí)也更有利于作為研究S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)理的底物。
a
b
ca: 重組角蛋白培養(yǎng)基; b: 化學(xué)水解角蛋白培養(yǎng)基; c: 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基圖6 S.maltophilia DHHJ不同來源角蛋白培養(yǎng)基下形態(tài)觀察
如圖7所示,羽毛粉、化學(xué)水解角蛋白、重組角蛋白均能誘導(dǎo)S.maltophiliaDHHJ分泌角蛋白酶。在角蛋白等誘導(dǎo)物作用下,S.maltophiliaDHHJ分泌大量的角蛋白酶。三種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中角蛋白酶活性變化趨于一致,24 h開始出現(xiàn)明顯的角蛋白酶活性,48 h角蛋白酶活性最高,隨著菌體消耗,角蛋白酶活性開始下降,但72 h時(shí),重組角蛋白M9培養(yǎng)基中角蛋白酶活性明顯高于其它兩組,由于化學(xué)水解角蛋白在菌體的作用下會析出,而重組角蛋白則不會,培養(yǎng)基中重組角蛋白含量相對較高,因此,角蛋白酶活性也較高。
圖7 三種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)S.maltophilia DHHJ分泌角蛋白酶
本文將角蛋白基因插入到pET32a(+)質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)。IPTG低溫誘導(dǎo)角蛋白基因大量表達(dá),利用Ni柱親和層析法分離純化得到重組角蛋白。重組角蛋白溶解性高于化學(xué)水解角蛋白,與S.maltophiliaDHHJ培養(yǎng)的過程中不會析出,重組角蛋白中帶有His-tag與S-tag等標(biāo)簽,有利于重組角蛋白的純化與鑒定。重組角蛋白具有生物活性能夠被S.maltophiliaDHHJ結(jié)合并誘導(dǎo)菌體分泌角蛋白酶,可用于后續(xù)S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)制的研究。