呂曉楠，徐立蒲，張 文，曹 歡，王小亮，王 姝，王靜波

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176）

鯉浮腫病（Carp edema virus disease，CEVD），也稱錦鯉昏睡?。↘oi sleepy disease，KSD），是由一種痘病毒感染鯉、錦鯉引起的高度傳染性流行病[1]，其病原為鯉浮腫病毒（Carp edema virus，CEV）?；疾◆~常出現(xiàn)爛鰓、凹眼、昏睡等癥狀，死亡率高達(dá)80%～100%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。該病已在全球迅速蔓延，我國在2016 年首次報道發(fā)生CEVD[5]。2018 年，CEVD 正式被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為水生動物疫病監(jiān)測對象，該病是我國一種新發(fā)水生動物疫病。

由于CEV尚無易感細(xì)胞系，其檢測方法主要依賴于熒光定量PCR、套式PCR等分子生物學(xué)方法[6-9]。這些方法均需要對檢測人員較高的技術(shù)要求，并難以滿足非實驗室等現(xiàn)場快速檢測及基層普及應(yīng)用。因此，有必要研究和建立快速、簡便和適用于現(xiàn)場CEV 檢測的新方法，以彌補現(xiàn)有方法的不足。

重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法（Recombinase-aid amplification，RAA）[10]/重組酶聚合酶擴(kuò)增法（Recombinase polymerase amplification，RPA）[11]等恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)為CEV 快速診斷提供了新的手段。它們替代了PCR 高溫變形循環(huán)過程，實現(xiàn)了在37 ℃～39 ℃常溫條件下，快速、靈敏檢測目的基因片段。依賴于特異性寡核苷酸引物或探針的側(cè)向流試紙條（Lateral flow dipstick，LFD）的RAA/RPA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測時間短、肉眼讀取結(jié)果、操作簡便等優(yōu)點。目前RAA/RPA快速檢測方法已經(jīng)應(yīng)用于蝦肝腸胞蟲?。‥HP）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、對蝦白班病毒（WSSV）和傳染性皮下造血組織壞死性病毒（IHHNV）等水生動物病原檢測領(lǐng)域[12-13]。SolimanH等采用RPA 技術(shù)建立了一種能夠同時檢測CEVD 和錦鯉皰疹?。↘HVD）的試紙條[14]，但該方法對我國流行CEVD 的檢出效果尚不可知。

本研究以RAA 技術(shù)為基礎(chǔ)，聯(lián)合膠體金LFD 技術(shù)，建立一種在臨床上能夠快速、準(zhǔn)確、特異地檢測CEV 的方法，同時為鯉和錦鯉CEVD 的有效防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株 鯉浮腫病毒（Carp edema virus，CEV）、錦鯉皰疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）、金魚造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV）、蛙虹彩病毒（Bohleiridovirus，BIV）、斑點叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV）由北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站鑒定保存，對蝦白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）標(biāo)準(zhǔn)品購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所。

1.2 主要試劑 RAA 基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒、RAA 試紙條型核酸擴(kuò)增試劑盒均購自杭州眾測生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒、熒光QuantiNovaTMProbe PCR Kit 均 購 自QIAGEN 公 司；DNA 擴(kuò) 增 試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；LFD 購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，該試紙條設(shè)有抗FAM 抗體檢測線和生物素化抗體質(zhì)控。

1.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 參照DNA 抽提試劑盒說明書，以提取的CEV 基因組DNA 為模板，根據(jù)CEV P4a 基因序列（MG550022.1），由北京天成新脈生物技術(shù)有限公司合成相應(yīng)基因序列，克隆到pEASY-T1 載體，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a，經(jīng)測序鑒定正確后，測定濃度并根據(jù)公式｛質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9/[660×（質(zhì)粒長度+載體長度）]｝×6.023×1023=質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝/μL）換算為其拷貝數(shù)。

1.4 RAA 引物篩選 依據(jù)RAA 引物設(shè)計原則，以NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 中CEV P4a 基 因 序 列（MH645915.1、KX254001.1、KX254004.1、KX254003.1、KX253997.1、KX254001.1） 保守區(qū)域為靶位點，采用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行序列比對分析，選取同源性高的片段，用Primer primer5.0 設(shè)計了4 對引物（表1）。利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a（6×105拷貝/μL）作為模板，以RAA 基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒對引物進(jìn)行篩選。擴(kuò)增反應(yīng)參照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為37 ℃孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RAA 產(chǎn)物。按照RAA-LFD 引物及探針設(shè)計原則，選擇擴(kuò)增條帶單一的1 對引物，對其下游引物和探針的5'端分別修飾6-羧基熒光素（6-FAM）和生物素（Biotin）。修飾后的引物及探針（CEV-2-nfo-F/R/P）用于后續(xù)RAA-LFD 方法的建立。以上引物及探針均由北京六合華大基因科技有限公司合成、標(biāo)記，具體信息詳見表1。

1.5 RAA-LFD 方法的優(yōu)化及建立 所有優(yōu)化試驗均以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a（6×105拷貝/μL）為模板。采用方陣法對標(biāo)記的引物（CEV-2-nfo-F/R）濃度（1 μmol/L、 5 μmol/L、 10 μmol/L、 50 μmol/L、100 μmol/L），反 應(yīng) 溫 度（25 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃），反應(yīng)時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系參照RAA 試紙條型核酸擴(kuò)增試劑盒。

所有優(yōu)化試驗的擴(kuò)增產(chǎn)物均通過LFD 檢測。為防止反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生的氣溶膠影響檢測結(jié)果，本試驗將50 μL RAA 反應(yīng)產(chǎn)物直接放置于裝置內(nèi)，與裝置自帶液泡緩沖液充分混合后豎立在水平操作臺上，3 min～5 min 后觀察并拍照記錄結(jié)果，選擇陽性樣品出現(xiàn)最強(qiáng)檢測線和質(zhì)控線而陰性樣品不出現(xiàn)檢測線僅出現(xiàn)質(zhì)控線時的條件作為RAA-LFD 的優(yōu)化條件。

表1 用于CEV 檢測的引物及探針信息Table 1 Sequences of primers and probes for CEV detection

1.6 特異性試驗 利用DNA 抽提試劑盒分別提取CEV、 KHV、GFHNV、EHNV、BIV、CCV、WSSV和EHP 的DNA，分別取100 ng 上述病毒DNA 為模板，利用已優(yōu)化的條件進(jìn)行RAA 擴(kuò)增反應(yīng)，在LFD上檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，驗證該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASYCEVP4a 進(jìn)行10 倍倍比稀釋（6×108拷貝/μL～6×100拷貝/μL），分別以其為模板進(jìn)行RAA-LFD、熒光定量PCR[8]檢測，并比較兩者的敏感性。RAA 擴(kuò)增反應(yīng)按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)LFD 檢測，確定該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗 選取6×105拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a 分為5 個標(biāo)本同時檢測。在第7 d 重復(fù)檢測保存于-20 ℃的模板，利用已優(yōu)化的條件進(jìn)行RAA 擴(kuò)增反應(yīng)，在LFD 上檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。

1.9 臨床樣品檢測 根據(jù)徐立蒲[2]報道的方法處理實驗室保藏的60 份臨床鯉和錦鯉（各30 份）組織樣品（魚的腦、脾、腎、鰓等）。利用DNA 抽提試劑盒提取樣品核酸，應(yīng)用本研究建立的CEV RAA-LFD方法和熒光定量PCR 方法[8]進(jìn)行檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果，并計算兩者的符合率。同時利用SolimanH[14]建立的RPA 方法（簡稱SolimanH 法）對上述60 份臨床樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 引物的篩選結(jié)果 根據(jù)RAA 的引物設(shè)計原則共設(shè)計了4 對CEV 特異性引物，利用RAA 基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒對引物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，4 對引物均能夠擴(kuò)增出目的條帶（圖1），隨機(jī)選擇CEV-2-F/CEV-2-R 引物作為建立RAA-LFD 方法用的引物，并在下游引物和探針5'端分別標(biāo)記FAM 和Biotin，用于后續(xù)LFD 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 CEV 的RAA 引 物 篩 選Fig.1 RAA primer screening for CEV detection

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 本研究對引物濃度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度分別進(jìn)行了優(yōu)化，綜合各試驗結(jié)果，最終確定引物濃度10 μmol/L、溫度37 ℃、RAA反應(yīng)10 min 作為最佳反應(yīng)條件。

2.3 特異性試驗 分別以KHV、GFHNV、EHNV、BIV、CCV、WSSV、EHP 的DNA 為模板檢測RAALFD 方法的特異性。結(jié)果顯示，僅以CEV 的DNA 為模板的RAA 擴(kuò)增產(chǎn)物在試紙條上同時出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線，而其它病原的擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)質(zhì)控線（圖2），無檢測線。表明該方法的特異性較強(qiáng)。

圖2 檢測CEV 的RAA-LFD 方法的特異性Fig.2 Specificity of the RAA-LFD assay for CEV detection

2.4 敏感性試驗 采用10 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a 作為模板，比較RAA-LFD 方法與熒光定量PCR 的敏感性。結(jié)果顯示，RAA-LFD 檢測方法對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a 的最低檢出限為6×100拷貝/μL（圖3A），與熒光定量PCR 的最低檢出限相同（圖3B）。表明本研究建立的RAA-LFD 具有較高的敏感性。

圖3 檢測CEV 的RAA-LFD 方法的敏感性Fig. 3 Sensitivity analysis of the RAA-LFD assay for CEV detection

2.5 重復(fù)性試驗 選取了6×105拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-CEVP4a 進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示RAA-LFD 5 個平行樣品目的片段均能夠擴(kuò)增，質(zhì)控線和檢測線均有條帶產(chǎn)生。第7 d 進(jìn)行組間重復(fù)性試驗，CEV 得到了有效擴(kuò)增，質(zhì)控線和檢測線均有條帶產(chǎn)生。表明本研究建立的RAA-LFD法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測 利用所建立的RAA-LFD 方法與熒光定量PCR 方法分別檢測臨床鯉和錦鯉組織樣品60 份，結(jié)果顯示RAA-LFD 檢測出陽性樣品49 份，陰性樣品11 份；熒光定量PCR 檢出陽性樣品51 份，陰性9 份。兩種方法的陽性符合率為96.08%。此外，SolimanH 法對同樣60 臨床樣品檢測出陽性樣品21份，陰性樣品39 份。

根據(jù)樣品來源分析，對于30 份錦鯉來源的樣品，本研究建立的RAA-LFD 和熒光定量PCR 陽性檢出率均為26/30，而SolimanH 法的陽性檢出率為21/30，SolimanH 法存在較大的漏檢情況。SolimanH法更無法檢出鯉來源的CEV 陽性樣品，該方法陽性檢出率為0。

綜上表明，本研究建立的RAA-LFD 方法更適合應(yīng)用于CEV 的現(xiàn)地檢測。

3 討 論

我國自2016 年徐立蒲等首次報道發(fā)生CEVD 以來，已陸續(xù)在北京、天津、廣州、杭州、河南、云南等多地確診了CEVD 的發(fā)生，其發(fā)病率顯著高于鯉春病毒（SVCV）和KHV 等鯉和錦鯉的重大疫病病原[2-5,15]，提示CEV 已經(jīng)成為對我國鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的病原之一。因此，CEVD 的防治迫在眉睫。

建立準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)地檢測方法，是有效防控CEVD 的保障。該病的臨床癥狀和病理變化容易與KHVD 相混淆，尤其是CEV 與SVCV、KHV 發(fā)生混合感染時，更容易發(fā)生誤診，給CEVD 的臨床診斷帶來一定的困難。目前CEV 國內(nèi)外沒有統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，通過實驗室近年來的研究表明，現(xiàn)階段對CEVD 的診斷主要采用流行特點、臨床癥狀以及分子生物學(xué)檢測相結(jié)合的方法。即當(dāng)同池魚僅鯉、錦鯉發(fā)病死亡，有爛鰓、凹眼、昏睡等癥狀時，熒光定量PCR 或套式PCR 檢測CEV 陽性時，可判定發(fā)生CEVD。這與CEV 尚無易感宿主細(xì)胞、全基因序列和相應(yīng)的蛋白等知之甚少有關(guān)。組織病理學(xué)和電鏡觀測病毒方法雖然直觀有效，但是樣品制備較為復(fù)雜，檢測周期長；目前所有的分子生物學(xué)研究僅參考CEV P4a 部分基因，而Nest-PCR 方法（Oyamatus/CEFAS 建立）存在嚴(yán)重的漏檢現(xiàn)象，且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳易產(chǎn)生氣溶膠污染[3,6,16]。相比之下漏檢率稍低的熒光定量PCR 則需要昂貴的檢測設(shè)備和需要專業(yè)人員操作等。綜上，上述方法均不適用于CEV 的現(xiàn)場快速檢測。

RAA 是一種借助于重組酶、聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白的新型等溫擴(kuò)增技術(shù)。與其它DNA 擴(kuò)增技術(shù)相比，它不需要特殊設(shè)備即可在更短時間內(nèi)和較低溫度下擴(kuò)增目的DNA 至可檢測水平。LFD 技術(shù)是一種不需要昂貴和復(fù)雜儀器以及訓(xùn)練有素的人員即可操作的可視化檢測工具。本研究聯(lián)合兩種技術(shù)，按照RAA 引物原則設(shè)計引物及探針，在其5'端分別進(jìn)行6-羧基熒光素（6-FAM）和生物素（Biotin）標(biāo)記，通過RAA 引物濃度、反應(yīng)時間、溫度等條件的優(yōu)化，建立了一種適用于我國鯉和錦鯉養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測CEV的RAA-LFD 方法。該檢測方法在34 ℃～40 ℃恒溫反應(yīng)10 min 即可實現(xiàn)對CEV 目的基因片段的有效擴(kuò)增；操作簡便，并與其它常見水生動物疫病病原DNA 無交叉反應(yīng)；RAA 擴(kuò)增產(chǎn)物直接用LFD 肉眼觀察，最低檢測限為6 拷貝/μL，敏感性與熒光PCR 相當(dāng)；對60 份臨床樣本進(jìn)行檢測，兩種方法符合率可達(dá)到96.08%，本研究建立的RAA-LFD 方法可用于CEV 的現(xiàn)地檢測。

此外，本研究還采用SolimanH 法對我國鯉和錦鯉樣品CEV 檢測進(jìn)行了評價。對實驗室保藏的60 份臨床樣本RAA-LFD 檢測中，錦鯉來源的CEV 陽性樣本的檢出率在70%；而鯉來源的CEV 陽性樣本的檢出率為0。綜上表明SolimanH 法可能主要能夠檢測我國錦鯉CEV，而對于我國鯉的CEV 檢測效果還有待進(jìn)一步評價。從近年對CEV 的監(jiān)測以及國內(nèi)外已報道中發(fā)現(xiàn)Oyamatsu 構(gòu)建的套式PCR 存在一定的漏檢，而SolimanH 的RAA-LFD 引物也同樣出自同樣的片段，這提示P4a 的548 部分基因不夠保守，本研究正是選取CEV P4a 保守部分（同熒光PCR 部分片段），優(yōu)化建立快建方法，以滿足我國鯉和錦鯉CEV 的現(xiàn)場快速檢測需求，檢測結(jié)果優(yōu)于SolimanH法。此外，更加突顯了開發(fā)或建立CEV 易感細(xì)胞系的迫切需求。

綜上，本研究建立了CEV 的RAA-LFD 快速檢測方法，操作簡單、特異性好、靈敏度高，可直觀地觀察反應(yīng)結(jié)果，特別適用在養(yǎng)殖現(xiàn)場等基層單位針對錦鯉進(jìn)行CEV 快速檢測，適合普及應(yīng)用。該技術(shù)的應(yīng)用將為CEVD 控制措施提供檢測技術(shù)支撐。