基于黃麻轉(zhuǎn)錄組序列SNP 位點的CAPS 標記開發(fā)與驗證

陶愛芬 游梓翊 徐建堂 林荔輝 張立武 祁建民,* 方平平,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院, 福建福州 350002; 2 福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室 / 福建省分子設(shè)計育種實驗室, 福建福州 350002

黃麻屬于椴樹科(Tiliaceae)黃麻屬(CorchorusL.)一年生草本植物, 其韌皮纖維具有易降解、透氣性強、吸水性好等優(yōu)點。近年來, 黃麻纖維被廣泛應(yīng)用于建材和可降解地膜等產(chǎn)業(yè)[1]。但與苧麻、亞麻等相比, 黃麻韌皮纖維細胞壁木質(zhì)化程度較高、纖維素含量較低, 導(dǎo)致纖維粗、硬, 品質(zhì)不佳, 使其只適合加工繩索和包裝用麻袋等, 限制了黃麻在紡織業(yè)等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。目前, 國內(nèi)外研究人員已克隆了包括4CL 和COMT 在內(nèi)的多個木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因[3]。而 MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的成員之一, 它參與并對植物生長和發(fā)育的各個方面產(chǎn)生重大影響, 在植物次生代謝調(diào)節(jié)、激素和環(huán)境因子反應(yīng)、細胞分化、器官形態(tài)發(fā)生和細胞周期調(diào)節(jié)中均有重要作用[4]。若能開發(fā)出與黃麻木質(zhì)素合成和MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的標記, 則將為黃麻種質(zhì)資源鑒定、育種親本選配和遺傳學(xué)研究等提供重要方法。

生物的遺傳因子受到多個因素的影響, 并在基因組水平上產(chǎn)生一定的波動。而分子標記技術(shù)是直接反映DNA 分子水平多態(tài)性的技術(shù), 與其他標記相比, 具有無表型效應(yīng)、分布廣、多態(tài)性高等優(yōu)點, 并且不受環(huán)境的影響[5-6]。近年來取得長足發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù), 具有通量高、分辨率高、不受限制等優(yōu)點[7-8]。利用該技術(shù)可以獲得大量潛在的 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)和 SSR (Simple Sequence Repeat)標記, 并用于各種分子生物學(xué)研究[9-10]。與其他標記方法相比, SNP 標記遺傳穩(wěn)定性高、位點分布廣泛且富有代表性, 因此已成為當前研究最多的分子標記之一[11-12]。雖然SNP 的檢測方法眾多, 但大部分方法均有其不足, 例如操作繁瑣或者成本過高, 從而限制了其在植物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用[13-14]。其中較經(jīng)濟并且適合常規(guī)分子生物學(xué)實驗的方法, 是把SNP 多態(tài)轉(zhuǎn)化成酶切擴增多態(tài)性(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS)標記或衍生CAPS (Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, dCAPS)標記[15]。王彩芬等[16]和司文潔等[17]研究表明, CAPS 標記技術(shù)具有多態(tài)性高、共顯性、所需DNA 量少、操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點。CAPS 分子標記技術(shù)建立以來, 已經(jīng)在水稻、小麥、玉米、大豆、番茄、馬鈴薯等作物中得到廣泛應(yīng)用[18-21]。

目前, 分子標記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于黃麻遺傳多樣性分析、起源與演化、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究上[22-26]。關(guān)于黃麻分子標記的開發(fā)已取得一些進展,例如SSR 標記[27-29]、SNP 標記[30-31]都已被開發(fā)利用,但是關(guān)于黃麻CAPS 標記的開發(fā), 未見有相關(guān)文獻報道, 而與黃麻木質(zhì)素合成基因和MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的CAPS 標記的開發(fā)與驗證, 更是未見報道。鑒于CAPS 分子標記的優(yōu)點及其在黃麻上開發(fā)應(yīng)用的滯后性, 開展該研究是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 用于CAPS 引物多態(tài)性驗證的黃麻品種名稱和類型Table 1 Name and type of jute accessions used in the validation of CAPS markers

1.1.1 植物材料 用于轉(zhuǎn)錄組測序的黃麻材料為黃麻179 和愛店野生種。2017年4月種植于福建農(nóng)林大學(xué)田間科技園, 采用盆栽栽培, 每盆10 株, 3 次重復(fù), 出苗后30 d, 真葉長到7～8 片時, 取莖和葉混合進行轉(zhuǎn)錄組測序。用于CAPS 多態(tài)性引物篩選驗證的12 份黃麻種質(zhì)資源的名稱和類型見表1。所有材料均為盆栽, 于2017年8月份播種, 每盆10 株,置自然條件下生長, 長至5～6 片真葉時, 取幼嫩葉片混合后提取DNA。

1.1.2 試劑及儀器 DNA 提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶等購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司, 其他常用試劑為實驗室分析純常規(guī)試劑; PCR 儀為德國Eppendorf 公司的MC-gradient; 電泳儀購自六一儀器廠(北京), 型號為DYY-6。

1.2 方法

1.2.1 黃麻轉(zhuǎn)錄組測序和SNP 位點鑒別 基于Illumina HiSeq 4000 測序技術(shù)平臺, 構(gòu)建黃麻轉(zhuǎn)錄組文庫并進行建庫測序, 獲得黃麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上, 采用GATK 針對RNA-Seq的SNP 識別流程, 進行SNP 多態(tài)性位點識別[32], 識別標準是, (1) 35 bp 范圍內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的單堿基錯配不超過3 個; (2)經(jīng)過序列深度標準化的SNP 質(zhì)量值大于2.0。

1.2.2 與4CL、COMT 和MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的黃麻SNP 引物設(shè)計 在黃麻轉(zhuǎn)錄組序列中, 尋找與木質(zhì)素合成酶基因4CL 和COMT 以及MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的unigene, 并采用Oligo 8 設(shè)計SNP 引物, 主要參數(shù)為： (1)引物長度在18～25 bp 之間; (2) PCR 預(yù)期擴增產(chǎn)物大小在100～500 bp 之間; (3)退火溫度(Tm)在53～58℃之間, 上、下游引物的Tm值相差不大于4℃; (4)GC 含量在40%～60%之間。

1.2.3 CAPS 標記開發(fā)及內(nèi)切酶的選擇 采用dCAPS Finder 2.0 進行CAPS 引物開發(fā)和內(nèi)切酶的選擇, 主要步驟為, (1)在黃麻unigene 序列中尋找與CAPS 標記的PCR 擴增體系中SNP 引物相對應(yīng)的unigene 片段; (2)選取其SNP 位點前后各30 bp 長度的堿基序列; (3)將SNP 位點原序列和突變序列分別輸入 dCAPS Finder 2.0 的對話框中, 尋找可以對位點進行切割的限制酶, 其對應(yīng)的標記即為基于SNP的CAPS 標記。

1.2.4 黃麻DNA 的提取 采用北京百泰克生物公司的BioTeke 試劑盒, 按說明書提取DNA。

1.2.5 CAPS 標記的PCR 擴增體系構(gòu)建 采用束永俊等[14]的CAPS 標記的PCR 擴增程序, 反應(yīng)體系為20 μL, 包含DNA 2 μL、上下游引物各1 μL、PRR MIX 10 μL、無菌水6 μL。PCR 程序為95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 53℃退火30 s, 74℃延伸45 s,共9 個循環(huán); 95℃變性30 s, 53℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共14 個循環(huán); 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。

1.2.6 限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng) 按照內(nèi)切酶的使用說明書構(gòu)建限制性酶切反應(yīng)體系, 反應(yīng)體系可分為省時酶和非省時酶2 種。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳 用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測擴增和酶切產(chǎn)物, 電泳電壓為100 V, 電流為100 mA, 電泳時間為40 min, 電泳完成后用培清600 型凝膠成像儀觀察條帶并拍照記錄。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 按照擴增和酶切條帶的有無計數(shù), 當某一條帶出現(xiàn)時賦值為“1”, 不存在時賦值為“0”, 從而把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料。參照Nei 等[33]的方法求得品種之間的遺傳距離, 然后用DPS 軟件中的類平均聚類法(UPGMA)對12 份黃麻種質(zhì)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃麻轉(zhuǎn)錄組中SNP 位點的數(shù)量與分布

黃麻轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得72,674 條unigene序列, 檢測到的SNP 位點總數(shù)為67,567 個, 序列總長度為29,705,997 bp。在黃麻unigene 序列中, 平均每440 bp 會有一個SNP 位點。SNP 位點分布密度如表2 和圖1 所示。由表2 可知, 含0～1 個SNP 位點的unigene 序列最多, 有66,525 條, 占總數(shù)的91.53%;含2 個以上SNP 位點的unigene 序列數(shù)目急劇下降,其中含1～2 個SNP 位點的unigene 序列有2092 條,比例為2.88%; 含2～3 個SNP 位點的unigene 序列有1277 條, 占1.76%; 含3 個以上SNP 位點的unigene序列總數(shù)亦較少, 有2780 條, 比例為3.81%。表明絕大多數(shù)黃麻unigene 上含有單個SNP 位點, 含有2個及以上SNP 位點的unigene 數(shù)量不多, 總計約8%左右, 其中含5～8 個SNP 位點的unigene 數(shù)量尤其少, 比例非常低。

2.2 與4CL、COMT 及MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的CAPS 標記開發(fā)

在對與黃麻木質(zhì)素合成基因4CL、COMT 及MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的unigene 分析的基礎(chǔ)上, 共獲得39 對與上述基因及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的SNP 引物(表3)。其中和4CL 相關(guān)的SNP 引物最少, 僅有6 對, 和COMT 相關(guān)的有15 對, 數(shù)量居中, 而與MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的最多, 有 18 對。在此基礎(chǔ)上, 采用dCAPS Finder 2.0 軟件開發(fā)基于SNP 位點的CAPS標記, 共獲得26 對有酶切位點的CAPS 標記(表4),開發(fā)比率為66.7%, 這26 對CAPS 標記分別具有能被SspI、ClaI 和MseI 等17 種內(nèi)切酶識別的位點。

表2 黃麻unigene 中SNP 位點的分布密度表Table 2 Distribution density of SNP loci in the unigenes of jute

圖1 黃麻unigene 中SNP 位點分布的趨勢圖Fig. 1 Trend of SNP loci distribution in the unigenes of jute

由表4 可知, 在26 對CAPS 引物中, 僅有3 對與黃麻木質(zhì)素合成基因4CL 相關(guān), 比例為11.5%,其對應(yīng)的unigene 序列僅有一條, 即unigene_17597,能識別位點的內(nèi)切酶種類也僅有一種, 為SspI; 有9 對CAPS 引物與COMT 相關(guān), 占34.6%, 數(shù)量居中,它們分別與 unigene_04800、unigene_09002 和unigene_08713 等3 條unigene 序列相對應(yīng), 能識別變異位點的內(nèi)切酶也分別有3 種, 即ClaI、BsiYI和AvaIII; 而與MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的CAPS 標記最多, 有14 對, 占總數(shù)的53.8%, 其對應(yīng)的unigene 序列有 14 條, 各不相同, 除 MYBCAPS8 和MYBCAPS13 對應(yīng)的內(nèi)切酶均為SecI 之外, 其他內(nèi)切酶種類也均有所不同。表明在3 種CAPS 標記中,與MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的CAPS 標記具有多樣化的、可以被多種內(nèi)切酶識別的SNP 變異位點。

表3 39 對SNP 引物的編號、名稱及序列Table 3 Name and sequence of 39 pairs of SNP primers

(續(xù)表3)

表4 CAPS 引物名稱、對應(yīng)的unigene 編號及內(nèi)切酶名稱Table 4 Name, corresponding unigene code, and endonuclease name of CAPS primers

(續(xù)表4)

2.3 多態(tài)性CAPS 引物的篩選

對上述26 對CAPS 引物進行PCR 擴增和酶切處理表明, 有11 對CAPS 引物的PCR 產(chǎn)物可以被酶切開來, 得到多態(tài)性條帶(表4 中黑體字標注, 擴增結(jié)果見圖2), 占總數(shù)的42.31%, 而另外15 對引物的PCR 產(chǎn)物無法被酶切開, 雖然有清晰的條帶但沒有多態(tài)性。在多態(tài)性CAPS 引物中, 與木質(zhì)素合成酶基因COMT 相關(guān)的引物有6 對(54.5%), 與MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的引物有5 對(45.5%), 二者數(shù)量相當, 而未獲得和4CL 相關(guān)的多態(tài)性CAPS 標記引物。

2.4 多態(tài)性CAPS 標記的驗證

以12 個黃麻品種為材料, 對所篩選的11 對CAPS 標記的有效性進行驗證。聚類分析表明(圖3),在遺傳相似系數(shù)為0.5 處畫線時, 12 個黃麻品種被區(qū)分為2 個不同的類群, 第I 個類群包括7 個品種, 除“日本5 號”外, 其他6 個品種均為圓果種黃麻; 第II個類群包括5 個黃麻品種, 均為長果種黃麻。由此可見, 所用的黃麻材料大致有按2 個不同栽培類型,即長果種和圓果種黃麻區(qū)分的趨勢。來自日本的圓果種黃麻“日本大分青皮”和長果種黃麻“日本5 號”被聚在一起, 推測這2 個品種雖然屬于不同的栽培類型, 但其木質(zhì)素合成相關(guān)的基因以及MYB 轉(zhuǎn)錄因子均可能有很高的相似性, 因而聚在同一個小類群中。同時進一步細分發(fā)現(xiàn), 在第I 個類群中, “臺灣加利麻”和“龍溪長果”又各自成一類, 沒有和其他品種的黃麻聚在一起, 推測這2 個品種的木質(zhì)素合成相關(guān)的基因以及MYB 轉(zhuǎn)錄因子較為特殊, 與其他品種有所區(qū)別。綜上所述, 所篩選出來的11 對CAPS多態(tài)性標記, 可以將12 份不同類型的黃麻品種較好地區(qū)別開來, 驗證了所開發(fā)的CAPS 標記的有效性和可行性。

圖2 COMT CAPS1-3 引物擴增和酶切結(jié)果Fig. 2 Amplified and enzyme digestion result of CAPS primer COMT CAPS1-3

圖3 12 份黃麻品種基于CAPS 標記的聚類圖Fig. 3 Dendrogram of 12 jute accessions based on CAPS markers

3 討論

3.1 黃麻轉(zhuǎn)錄組中SNP 位點的分布

SNP 是由單堿基突變引起的DNA 序列多態(tài)性,具有數(shù)量豐富、分布廣泛、覆蓋度高等特點[34]。黃麻轉(zhuǎn)錄組序列中共檢測到67,567 個SNP 位點, 平均每440 bp 出現(xiàn)一個SNP 位點, 與其他作物相比較,出現(xiàn)的頻率較低。前人研究表明, 水稻基因組中約268 bp 存在1 個SNP[35], 玉米基因組中每60～120 bp就存在1 個SNP[36], 大豆基因組中每185～266 bp 有1 個SNP[37], 而茶樹基因組中平均每172 bp 有1 個SNP[38]。SNP 出現(xiàn)的頻率, 第一, 與物種本身基因組的差異有關(guān), 不同物種不同。第二, 存在于非編碼序列中的SNP 會提高SNP 出現(xiàn)的頻率[39], 而黃麻中存在于非編碼序列的SNP 位點較少, 導(dǎo)致其出現(xiàn)的頻率降低。第三, 試驗樣本大小及測序長度也會影響SNP 的頻率[40], 今后應(yīng)進一步增加黃麻轉(zhuǎn)錄組的測序長度, 以提高SNP 的頻率。

3.2 所開發(fā)CAPS 標記的多態(tài)性

本試驗的CAPS 標記是在前期黃麻轉(zhuǎn)錄組序列中SNP 位點的基礎(chǔ)上開發(fā)的。SNP 標記因為在基因組中分布廣泛、遺傳穩(wěn)定等特點, 在植物遺傳育種研究方面有巨大的優(yōu)勢, 但是由于檢測手段的限制,阻礙了SNP 標記的廣泛應(yīng)用。而CAPS 方法無需昂貴的設(shè)備、操作簡單, 可以實現(xiàn)中通量的 SNP 檢測,因而可以大大促進SNP 標記在植物遺傳育種中的應(yīng)用[38]。本研究以39 對SNP 引物為基礎(chǔ), 獲得了26對CAPS 標記, 開發(fā)成功的比率為66.7%, 與柑橘(65%)和水稻(67.8%)的成功率相似[17,41], 但低于茶樹和大豆SNP 快速轉(zhuǎn)化為CAPS 方法的比例(81.8%和 86.21%), 高于大豆傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化的比例(52.51%)[14]。造成這種差異的原因, 首先與酶切位點選擇和分析的標準有關(guān), 嚴格的酶切位點選擇和分析標準, 可以提高轉(zhuǎn)化的成功率[38]; 其次, 由于某些SNP 并未引起限制性內(nèi)切酶識別位點的改變, 不能直接使用內(nèi)切酶進行檢測; 再次, 若在同一擴增產(chǎn)物中存在多個與SNP 所在酶切識別位點相同的酶切位點, 直接使用內(nèi)切酶檢測難以分辨[19]。另外, 多態(tài)性CAPS 引物所占的比率為42.3%, 也比較低。原因可能是本研究開發(fā)的CAPS 引物是和4CL、COMT等木質(zhì)素合成酶基因及MYB 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的, 針對性和目的性較強, 而所用的供試材料在這些位點僅有部分多態(tài)性, 從而導(dǎo)致多態(tài)性引物的比率降低。也有可能是物種本身的特異性引起的, 潛宗偉等研究亦表明, 分子標記引物的多態(tài)性比率因物種不同而有所差異[42]。

3.3 所開發(fā)CAPS 標記的有效性

所開發(fā)的CAPS 標記引物可以將供試的12 份黃麻種質(zhì)較好地區(qū)別開來, 供試材料有大致按栽培類型, 即長果種黃麻和圓果種黃麻聚類的趨勢。同時,來自日本的2 個品種聚在一起, 體現(xiàn)了按種質(zhì)地理來源聚類的特點。另外, 基于CAPS 標記的聚類分析也能鑒別出個別特異的種質(zhì)類型, 如臺灣加利麻。以上結(jié)果均表明, 所開發(fā)的CAPS 標記在黃麻遺傳多樣性分析上是有效和可行的, 且可用于黃麻種質(zhì)資源鑒定等研究, 為黃麻雜交育種親本選配提供理論依據(jù)。綜上所述, 本試驗所開發(fā)的黃麻CAPS標記是黃麻遺傳育種研究中的一項理想的分子標記方法, 可為黃麻分子標記輔助育種和性狀改良提供有效方法。

4 結(jié)論

對黃麻轉(zhuǎn)錄組序列中的SNP 位點進行了分析,發(fā)現(xiàn)平均每440 bp 出現(xiàn)一個SNP 位點, 其分布頻率低于其他作物, 推測與物種之間的基因組差異性有關(guān), 而黃麻中存在于非編碼序列的SNP 位點較少也是影響因素之一。同時, 設(shè)計了與黃麻木質(zhì)素合成基因4CL、COMT 及轉(zhuǎn)錄因子MYB 相關(guān)的39 對SNP引物, 并以此為基礎(chǔ)開發(fā)了26 對CAPS 標記, 開發(fā)成功率為66.7%, 其中11 對CAPS 標記具有多態(tài)性,多態(tài)性比例為43.2%。開發(fā)的CAPS 標記能較好地將12 份不同類型的黃麻種質(zhì)按栽培類型區(qū)分開來,同時亦能鑒別出特異種質(zhì), 表明所開發(fā)的CAPS 是適用于黃麻種質(zhì)資源鑒定的較理想的分子標記方法,可為黃麻雜交育種親本選配提供理論依據(jù), 同時也為黃麻分子標記輔助選擇育種提供了有效方法。