磁鐵礦納米顆粒與Pb2+復(fù)合物對(duì)大鼠腎細(xì)胞的毒性研究

陳力可，郭昌勝，劉淼，李專，徐建,*

1. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與研究中心，北京 100012 2. 吉林大學(xué)新能源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130012 3. 吉林省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，長(zhǎng)春 130011

隨著現(xiàn)代社會(huì)工業(yè)的快速發(fā)展，水體污染日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為威脅和制約人類健康和發(fā)展的重要因素。鉛(Pb)是一種重金屬元素，也是水環(huán)境中持久性污染物，會(huì)對(duì)水生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生廣泛和嚴(yán)重的危害[1]。有研究指出，在環(huán)境濃度水平的Pb2+(0.02 μg·mL-1)溶液中暴露96 h即可導(dǎo)致斑馬魚的胚胎毒性及行為異常[2]。Pb2+暴露也會(huì)嚴(yán)重影響生物體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腎臟以及造血系統(tǒng)等，而腎臟是Pb2+在生物體中的主要排泄器官，也是Pb2+的主要靶器官[1,3]。Pb2+對(duì)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制目前還不完全清楚，相關(guān)研究表明，目前主要的作用機(jī)制包括導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式[4]。

近年來，磁鐵礦納米顆粒(magnetite nanoparticles, MNPs)作為一種新型材料越來越受到研究者的廣泛關(guān)注，MNPs比表面積大、反應(yīng)活性高，且具有簡(jiǎn)單易回收等特點(diǎn)，目前被廣泛用于水中重金屬元素Pb處理[5]。一項(xiàng)研究表明，海泡石和Fe3O4納米復(fù)合材料對(duì)水中Pb2+的吸附容量達(dá)到96.15 mg·g-1，效果遠(yuǎn)高出同類吸附劑，而且成本低廉[6]。因此，這種高效、經(jīng)濟(jì)的方法在污水治理行業(yè)中已被迅速地產(chǎn)業(yè)化。

雖然MNPs應(yīng)用范圍十分廣泛，但是關(guān)于MNPs處理金屬后形成的復(fù)合物對(duì)生物和環(huán)境的毒性研究卻很有限。而MNPs在生產(chǎn)、使用以及廢棄的過程中將不可避免地進(jìn)入水生環(huán)境[5]，MNPs相對(duì)于大顆粒物具有更大的比表面積，一旦進(jìn)入環(huán)境中，可顯著影響環(huán)境中污染物的環(huán)境行為，或?qū)е挛廴疚锷镉行院投拘孕?yīng)的改變，從而引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)。污染物之間的相互作用可分為加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用[7]。例如，全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅單獨(dú)與復(fù)合暴露均可造成斑馬魚胚胎的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，但復(fù)合暴露組的氧化損傷和細(xì)胞凋亡程度明顯大于單獨(dú)暴露組，表現(xiàn)出協(xié)同作用[8]。姜文博等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的納米二氧化鈦可劑量依賴性地引起心肌細(xì)胞DNA損傷，而叔丁基對(duì)苯二酚(tertbutylhydroquinone, tBHQ)與納米二氧化鈦聯(lián)合暴露可降低納米二氧化鈦導(dǎo)致的心肌細(xì)胞DNA損傷，表現(xiàn)出拮抗作用。協(xié)同或拮抗作用會(huì)直接或間接地增強(qiáng)或抑制污染物的毒性，因此，研究納米顆粒與污染物復(fù)合物的生物毒性效應(yīng)，對(duì)于評(píng)價(jià)其生物安全性及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的意義。目前，MNPs和Pb2+的毒性研究多限于單一MNPs或Pb2+在實(shí)驗(yàn)室條件下的毒性效應(yīng)分析，雖然研究發(fā)現(xiàn)MNPs對(duì)生物體是相對(duì)無毒或低毒性的[5,10]，但是MNPs-Pb復(fù)合物對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的毒性卻鮮有報(bào)道，其復(fù)合毒性亟待深入研究。

本研究在對(duì)MNPs、MNPs-Pb以及培養(yǎng)基等性質(zhì)進(jìn)行表征的基礎(chǔ)上，選取大鼠腎細(xì)胞作為毒性評(píng)價(jià)的細(xì)胞模型，研究不同Pb含量的MNPs-Pb，以及作為對(duì)比的相應(yīng)濃度的MNPs和Pb2+，對(duì)細(xì)胞活性、細(xì)胞形態(tài)和密度、細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取以及細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)MNPs-Pb潛在的毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。研究結(jié)果可為MNPs與重金屬復(fù)合物對(duì)環(huán)境的影響及生物安全性評(píng)估提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器和實(shí)驗(yàn)材料

MNPs為吉林大學(xué)新能源與環(huán)境學(xué)院提供，合成方法為共沉淀法[5]，納米顆粒為規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)，單分散性較好，粒徑為20～25 nm，經(jīng)過X射線衍射儀分析，其衍射峰與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡JCPDS 79-0491匹配良好，表明成分為Fe3O4。實(shí)驗(yàn)中MNPs所用分散劑為純水。Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg·L-1)購自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

腎臟是Pb2+毒性作用的主要靶器官之一[3]。大鼠腎細(xì)胞是研究Pb2+毒性的常用的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞[1,3]，購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

主要材料如下：胎牛血清(BR級(jí)，購于Gibco公司)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (BR級(jí)，購于Gibco公司)，Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液(BR級(jí)，購于Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基(BR級(jí)，購于Gibco公司)，ApopNexin Annexin V FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BC級(jí)，購于Merck Millipore公司)，WST-1細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(BC，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，戊二醛(BC級(jí)購于BASF公司)，檸檬酸鉛(GR級(jí)，購于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán))和四氧化鋨(GR級(jí)，購于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán))。

主要儀器及設(shè)備如下：微孔板分光光度計(jì)(Epoch，Bio Tek，美國(guó))，多維全景流式細(xì)胞儀(Merck FlowSight IS100，Millipore，德國(guó))，透射電子顯微鏡(TEM)(H-8100，Hitachi，日本)，倒置相差顯微鏡(Axio Vert.A1，Zeiss，加拿大)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(MIR-254-PC，Sanyo，日本)，低溫高速離心機(jī)(3K15，Sigma，德國(guó))，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)(Optima 8000，PE，美國(guó))，掃描電子顯微鏡(SEM)(JSM-6700F，JEOL，日本)，恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-300，上海一恒科技，中國(guó))，動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(Zetasizer Nano ZS，Malvern，英國(guó))。

大鼠細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液消化。取適量復(fù)合物MNPs-Pb或MNPs或Pb2+加入DMEM中，分別得到濃度為150 μg·mL-1MNPs-1 μg·mL-1Pb(記作MNPs-1 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-3 μg·mL-1Pb (記作MNPs-3 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-5 μg·mL-1Pb(記作MNPs-5 μg·mL-1Pb)；以及150 μg·mL-1MNPs、1 μg·mL-1Pb2+、3 μg·mL-1Pb2+和5 μg·mL-1Pb2+的培養(yǎng)基。分別將細(xì)胞暴露于以上濃度MNPs-Pb、Pb2+和MNPs培養(yǎng)基中12 h。

1.2 MNPs與Pb2+復(fù)合物的制備及表征

按照相關(guān)文獻(xiàn)，在適當(dāng)pH值的水溶液中進(jìn)行MNPs對(duì)Pb2+的吸附實(shí)驗(yàn)，用Langmuir模型計(jì)算MNPs對(duì)Pb2+吸附容量[6,11]。在確定MNPs對(duì)Pb2+吸附容量后，稱取多份1.2 g MNPs粉末，分別加入pH值為6的200 mL的40、120和200 μg·mL-1的Pb2+溶液中，37 ℃下震蕩24 h后，磁分離，用去離子水將分離后復(fù)合物清洗2遍后，冷凍干燥。制得MNPs與Pb2+的復(fù)合物MNPs-Pb：MNPs(150 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(50 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(30 mg)-Pb(1 mg)(上述MNPs-Pb的含量，只表示復(fù)合物中MNPs和Pb的質(zhì)量比例，并不代表絕對(duì)質(zhì)量)。最后將適量MNPs和MNPs-Pb超聲分散于DMEM培養(yǎng)基中，用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(DLS)測(cè)定納米顆粒的水合粒徑。

1.3 TEM表征

取經(jīng)過不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，按如下方法操作：(1)用PBS清洗細(xì)胞2遍；(2)傾去PBS，加入4 ℃的2.5%戊二醛溶液，固定15 min；(3)用細(xì)胞刮鏟輕輕將細(xì)胞從6孔板中刮下，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管內(nèi)，以3 000 r·min-1速度離心15 min，傾去上清液，并用PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次。然后將細(xì)胞沉淀再次離心，對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行固定、脫水、包埋和切片，用透射電鏡觀察細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取[12]。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁培養(yǎng)大鼠腎細(xì)胞，分別添加不同濃度梯度的MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養(yǎng)基，并設(shè)置對(duì)照組，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。用WST-1法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，使用微孔板分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各樣品及對(duì)照組的吸光度A450，計(jì)算細(xì)胞活性[13]。

1.5 細(xì)胞形態(tài)的光學(xué)顯微鏡觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腎細(xì)胞，分別經(jīng)過消化、離心后接種于6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱孵育12 h。取出6孔培養(yǎng)板，傾去原有培養(yǎng)基，分別加入2 mL含有不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度的改變[14]。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

取6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的經(jīng)過不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞。將細(xì)胞用AnnexinV FITC/PI染色法染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：在收集各樣品細(xì)胞數(shù)一致的條件下(每個(gè)樣品約8 500個(gè)細(xì)胞)，分別在525 nm和405 nm的激發(fā)波長(zhǎng)處采集AnnexinV FITC和PI的熒光強(qiáng)度，將樣品細(xì)胞分為早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、正?；罴?xì)胞和壞死細(xì)胞4類[15]。統(tǒng)計(jì)各類型細(xì)胞百分比，定量分析細(xì)胞凋亡水平。

通過明場(chǎng)(bright field)和熒光染色通道觀察細(xì)胞形態(tài)和染色的變化，對(duì)MNPs-Pb和Pb2+組細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行定性比較分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

納米顆粒綜合性質(zhì)表征、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡水平分析均來自3個(gè)平行樣品，每個(gè)平行樣品均重復(fù)測(cè)定4次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，并采用SPSS 18.0軟件對(duì)不同處理結(jié)果進(jìn)行方差分析，設(shè)定P<0.05為具有顯著性差異，P>0.05為不具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 納米顆粒及培養(yǎng)基的綜合性質(zhì)表征

納米顆粒及培養(yǎng)液的綜合性質(zhì)表征如表1所示。

為了避免添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb引起的培養(yǎng)基pH值變化影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)以及MNPs對(duì)Pb2+的吸附，用pH計(jì)對(duì)添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb的DMEM培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，添加MNPs和MNPs-Pb的培養(yǎng)基pH值接近中性，與空白DMEM比較，pH值沒有顯著改變；雖然加入不同濃度Pb2+的DMEM的pH值略有下降，這是因?yàn)镻b2+標(biāo)準(zhǔn)溶液為酸性，而pH值仍然接近中性。因此可知，通過培養(yǎng)液中緩沖液的調(diào)節(jié)，添加MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM的pH值略微改變，不會(huì)對(duì)細(xì)胞生理功能有顯著影響。相關(guān)研究表明，pH值的上升有利于MNPs對(duì)Pb2+吸附容量的增加，因?yàn)檩^高的pH值有利于吸附劑表面的去質(zhì)子化，導(dǎo)致負(fù)電荷點(diǎn)的增加，增強(qiáng)了吸附劑表面與Pb2+之間的引力，從而提高了吸附容量[11]。在pH值較低的區(qū)域，正電荷中心占主導(dǎo)地位，這增強(qiáng)了吸附劑表面與Pb2+之間存在的斥力，從而降低了MNPs對(duì)Pb2+的吸附容量。Nassar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在pH值≥6.5范圍內(nèi)，不利于Pb2+從MNPs-Pb上脫落。因此，本研究的pH條件不會(huì)對(duì)MNPs-Pb中Pb含量產(chǎn)生顯著影響。

動(dòng)態(tài)光散射是一種常見的膠體和懸浮體表征方法，多用于測(cè)定納米粒子的水合粒徑，水合粒徑更能表征納米顆粒在溶液中形成的團(tuán)聚體實(shí)際大小[16]。因?yàn)榧{米顆粒與細(xì)胞間的相互作用與其團(tuán)聚程度密切相關(guān)，團(tuán)聚體的大小是決定納米顆粒能否進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵因素[17-18]。由表1可知，MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb各顆粒之間的水合粒徑并無顯著差異，平均水合粒徑為441 nm。

2.2 對(duì)細(xì)胞活性影響的分析

選擇大鼠腎細(xì)胞作為受試細(xì)胞，用不同濃度的Pb2+、MNPs-Pb和MNPs作用12 h后，用WST-1法測(cè)定細(xì)胞活性，測(cè)試結(jié)果如圖1所示。在相同作用時(shí)間內(nèi)，MNPs-Pb組細(xì)胞的活性明顯高于Pb2+組細(xì)胞的活性。具體而言，MNPs-Pb組細(xì)胞的活性在80%～90%之間，不呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)性。而Pb組細(xì)胞的活性，均顯著低于對(duì)照組。只有1 μg·mL-1Pb2+處理組的細(xì)胞活性為83.2%±7.1%，與MNPs-1 μg·mL-1Pb組的細(xì)胞活性沒有顯著性差異，其余Pb2+各組均顯著低于相應(yīng)的MNPs-Pb組，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。MNPs和MNPs-Pb組的細(xì)胞活性雖然有輕微的降低，但是各組之間沒有顯著性差異，也未發(fā)現(xiàn)與MNPs-Pb中Pb濃度有劑量相關(guān)性。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果說明，MNPs-Pb復(fù)合物較穩(wěn)定，沒有大量有毒Pb2+溶出，同時(shí)可以推測(cè)，MNPs和MNPs-Pb對(duì)細(xì)胞毒性很小。

2.3 細(xì)胞形態(tài)變化分析

分別用濃度為1、3和5 μg·mL-1的Pb2+和MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb作用大鼠腎細(xì)胞12 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞密度變化，結(jié)果如圖2所示。

表1 加入MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養(yǎng)基的綜合性質(zhì)表征Table 1 Comprehensive property of culture medium (DMEM) with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：MNPs表示磁鐵礦納米顆粒，所有MNPs處理濃度均為150 μg·mL-1。

Note: MNPs stand for magnetite nanoparticles, and the MNPs concentration in all its treatments is 150 μg·mL-1.

圖1 對(duì)照組、Pb2+、MNPs和MNPs-Pb各處理組的細(xì)胞活性注：a為對(duì)照組，b為1 μg·mL-1 Pb2+組，c為3 μg·mL-1 Pb2+組，d為5 μg·mL-1 Pb2+組，e為MNPs組，f為MNPs-1 μg·mL-1 Pb組，g為MNPs-3 μg·mL-1 Pb組，h為MNPs-5 μg·mL-1 Pb組；*和#分別表示各處理組與對(duì)照組、MNPs-Pb組與相應(yīng)濃度Pb2+組比較具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Viability of control cells and cells treated with Pb2+, MNPs and MNPs-PbNote: a. Control group, b. 1 μg·mL-1 Pb2+ group, c. 3 μg·mL-1 Pb2+ group, d. 5 μg·mL-1 Pb2+ group, e. MNPs group, f. MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, g. MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, h. MNPs-5 μg·mL-1 Pb group; significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by # when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+ groups without MNPs.

由圖2可知，對(duì)照組細(xì)胞(圖2(b))生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈規(guī)則的多邊形，貼壁生長(zhǎng)；細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞質(zhì)清亮，細(xì)胞邊界清晰；細(xì)胞排列整齊，大小均一，且細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞密度較大。

1 μg·mL-1Pb2+組細(xì)胞(圖2(d))與對(duì)照組比較，形態(tài)改變不明顯，隨著Pb2+作用劑量的增加，Pb2+組細(xì)胞(圖2(d)、圖2(f)和圖2(h))形態(tài)改變逐漸明顯；可見貼壁細(xì)胞數(shù)目不斷減少、變小和變圓，而懸浮細(xì)胞數(shù)目不斷增加，且細(xì)胞排列雜亂、形狀不規(guī)則、折光性差，細(xì)胞連接被破壞、間隙增大。

MNPs組(圖2(a))和MNPs-Pb組細(xì)胞(圖2(c)、圖2(e)和圖2(g))，細(xì)胞形態(tài)飽滿、胞質(zhì)清亮、細(xì)胞間隙較小，與對(duì)照組比較，沒有明顯變化。MNPs-Pb組細(xì)胞與相應(yīng)濃度Pb2+組細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)只有1 μg·mL-1Pb2+組細(xì)胞(圖2(d))和MNPs-1 μg·mL-1Pb組細(xì)胞(圖2(c))形態(tài)沒有明顯差異，其余各組形態(tài)均差異明顯。以上結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，Pb2+對(duì)細(xì)胞毒性作用更強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)MNPs和MNPs-Pb具有強(qiáng)烈毒性而導(dǎo)致大鼠腎細(xì)胞形態(tài)和密度的顯著改變。

2.4 細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取分析

細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取，受到納米顆粒濃度和粒徑大小、細(xì)胞的種類和數(shù)量等因素的影響，而納米顆粒的大小被普遍認(rèn)為是決定細(xì)胞攝取納米顆粒的主要因素[17-18]。本研究中，細(xì)胞種類相同、數(shù)量一致且納米顆粒濃度相等，只需比較納米顆粒水合粒徑大小。由于MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb之間的水合粒徑?jīng)]有顯著差異，細(xì)胞對(duì)3種納米顆粒的攝取難易程度一致。選取MNPs-5 μg·mL-1Pb和MNPs作用12 h后的細(xì)胞，通過TEM觀察，研究細(xì)胞對(duì)MNPs-Pb和MNPs的攝取，結(jié)果如圖3所示。

觀察中只發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞攝取了MNPs和MNPs-Pb，圖3(a)和圖3(b)中可分別觀察到在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)吞囊泡中的MNPs和MNPs-Pb。

2.5 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響分析

為了確定細(xì)胞凋亡水平，實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞采用AnnexinV-FITC/PI熒光染色法，并用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。在總細(xì)胞數(shù)一致的條件下，對(duì)各組細(xì)胞的凋亡早期、凋亡晚期細(xì)胞百分比含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，研究MNPs、Pb2+和MNPs-Pb對(duì)大鼠腎細(xì)胞凋亡水平的影響。細(xì)胞早、晚期凋亡水平如表2和表3所示。

圖3 細(xì)胞的TEM圖注：(a) MNPs組，(b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb組。Fig. 3 TEM images of cellsNote: (a) MNPs group, (b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

表2 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+對(duì)細(xì)胞早期凋亡水平的影響Table 2 Early apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*為與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)；#為MNPs-Pb組與相應(yīng)濃度Pb2+組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

表3 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+對(duì)細(xì)胞晚期凋亡水平的影響Table 3 Late apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*為與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)；#為MNPs-Pb組與相應(yīng)濃度Pb2+組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

由表2和表3可知，經(jīng)過不同濃度Pb2+作用12 h后的大鼠腎細(xì)胞，與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡水平均有顯著升高。具體而言，1 μg·mL-1Pb2+僅導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡水平的升高，隨著劑量的增加，細(xì)胞早、晚期凋亡水平均顯著增加，顯示出劑量相關(guān)性，說明Pb2+濃度的增加促進(jìn)了大鼠腎細(xì)胞的凋亡。MNPs組細(xì)胞，早、晚期凋亡水平與對(duì)照組比較略有增加，未發(fā)現(xiàn)凋亡水平有顯著性差異。而MNPs-Pb組與對(duì)照組比較，早、晚期凋亡水平有一定程度的增加，只有早期凋亡水平有顯著性差異，與相應(yīng)濃度Pb2+組比較，凋亡水平明顯降低。

MNPs-Pb組(圖4(d)、圖4(e)和圖4(f))與相應(yīng)濃度Pb2+組(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))的凋亡細(xì)胞熒光染色形態(tài)結(jié)果如圖4所示。通過明場(chǎng)通道觀察，Pb2+組與MNPs-Pb組比較，凋亡早期細(xì)胞質(zhì)膜皺縮變小更嚴(yán)重，形態(tài)改變更明顯，凋亡細(xì)胞形態(tài)變化更顯著。而通過熒光通道觀察，分別比較Pb2+組與MNPs-Pb組的凋亡早期和凋亡晚期的細(xì)胞，Annexin V-FITC的染色增強(qiáng)、熒光明亮，形成了致密濃縮的熒光特征，PI染色也呈現(xiàn)同樣熒光特征，提示質(zhì)膜的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)外翻以及對(duì)細(xì)胞核破壞更嚴(yán)重，發(fā)生了更顯著的細(xì)胞凋亡。因此，通過對(duì)熒光染色的凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察，也證實(shí)了MNPs對(duì)Pb2+的吸附能夠顯著降低Pb2+導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡水平，與表2和表3結(jié)果一致。

圖4 細(xì)胞經(jīng)過Pb2+與MNPs-Pb作用12 h后凋亡早、晚期細(xì)胞熒光染色形態(tài)圖注：(a) 1 μg·mL-1 Pb2+組，(b) 3 μg·mL-1 Pb2+組，(c) 5 μg·mL-1 Pb2+組，(d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb組，(e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb組，(f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb組。Fig. 4 Fluorescent staining and morphology of early and late apoptosis cells treated with Pb2+ and MNPs-Pb after 12 hNote: (a) 1 μg·mL-1 Pb2+ group, (b) 3 μg·mL-1 Pb2+ group, (c) 5 μg·mL-1 Pb2+ group, (d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, (e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, (f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

3 討論(Discussion)

體外毒性實(shí)驗(yàn)是納米毒理學(xué)的重要評(píng)估方法。本研究使用大鼠腎細(xì)胞作為研究對(duì)象，評(píng)估MNPs-Pb復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果說明，高劑量Pb2+作用能導(dǎo)致大鼠腎細(xì)胞活性的顯著性降低及形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯著改變；MNPs-Pb復(fù)合物顯著降低了Pb2+對(duì)細(xì)胞活性的抑制和對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯著改變，復(fù)合物和MNPs對(duì)細(xì)胞活性只有輕微抑制，對(duì)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)沒有顯著改變。有研究發(fā)現(xiàn)，MNPs在<200 μg·mL-1條件下對(duì)細(xì)胞沒有顯著毒性效應(yīng)，在濃度高達(dá)400 μg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞也只有程度較低的活性抑制和形態(tài)改變，未表現(xiàn)出顯著毒性[10,19]。Hildebrand等[20]研究動(dòng)物細(xì)胞暴露于MNPs與Pd的復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性短期內(nèi)略微降低，作者認(rèn)為這可能是細(xì)胞短期內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果，不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著毒性作用。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了MNPs-Pb對(duì)細(xì)胞無顯著的毒性作用。

納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的攝取與細(xì)胞毒性直接相關(guān)，其毒性作用通常與3個(gè)方面有關(guān)：(1)納米顆粒進(jìn)入重要細(xì)胞器，如線粒體、細(xì)胞核等，影響細(xì)胞正常生理功能[19]；(2)產(chǎn)生“木馬效應(yīng)”，即納米顆粒攜帶有毒“金屬離子”釋放到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞毒性的增加[21]；(3)納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)溶解，釋放出大量有毒金屬離子[22]。納米顆粒通過內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取主要分為3種類型：吞飲作用、吞噬作用和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，最常見的是非特異性的吞飲作用，以質(zhì)膜包被顆粒物，內(nèi)陷形成囊泡及初級(jí)溶酶體[17]。由于MNPs-Pb表面無生物配體，因此非特異性的吞飲作用可能是其進(jìn)入細(xì)胞的方式。非特異性的內(nèi)吞作用與納米顆粒尺寸密切相關(guān)，相同納米濃度下，較小的顆粒更易于被細(xì)胞攝取[17-18]。納米顆粒被細(xì)胞有效攝取的尺寸閾值為200 nm[17]，由于MNPs-Pb和MNPs水合粒徑均大于此閾值，且MNPs-Pb的水合粒徑更大，因此在相同納米顆粒濃度下，細(xì)胞對(duì)MNPs-Pb和MNPs的攝取量很低，且MNPs-Pb攝取量低于對(duì)MNPs的攝取量。研究發(fā)現(xiàn)，多種磁性氧化鐵納米材料被細(xì)胞攝取后，通常會(huì)聚集于內(nèi)體、溶酶體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在重要細(xì)胞器中未發(fā)現(xiàn)納米顆粒[19,22]，與本研究中TEM觀察結(jié)果一致。

對(duì)裸核MNPs和表面修飾的MNPs的一項(xiàng)研究表明，進(jìn)入細(xì)胞溶酶體內(nèi)的納米顆粒96 h后仍保持原有化學(xué)形態(tài)，對(duì)細(xì)胞沒有顯著毒性影響[22]，因此，12 h的暴露時(shí)間內(nèi)，MNPs和MNPs-Pb在細(xì)胞內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，可能不會(huì)有大量Fe2+/Fe3+溶解。而另一項(xiàng)關(guān)于MNPs對(duì)Pb2+的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，形成的MNPs-Pb在1 mmol·L-1的硝酸作用下，僅有少量Pb2+溶解到溶液中，而未加入硝酸的溶液中，幾乎沒有Pb2+從MNPs-Pb上脫落[11]。由于<2.07 μg·mL-1的Pb2+對(duì)細(xì)胞影響較小[23]，在接近中性的生理環(huán)境中，12 h的暴露時(shí)間，微量的MNPs-Pb被細(xì)胞攝取，可能不會(huì)有大量能導(dǎo)致細(xì)胞毒性的Pb2+脫落。Auffan等[21]研究與MNPs性質(zhì)類似的納米γ-Fe2O3與As的復(fù)合物對(duì)動(dòng)物細(xì)胞作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，即細(xì)胞對(duì)復(fù)合納米顆粒的微量攝取，在細(xì)胞內(nèi)未發(fā)生“木馬效應(yīng)”導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性。綜上所述，被攝取的微量MNPs-Pb可能不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著毒性效應(yīng)。

盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是半胱天冬酶(caspase)在凋亡過程中起著必不可少的作用。細(xì)胞凋亡主要包含2種重要機(jī)制，對(duì)于外源性凋亡，外來信號(hào)與死亡受體發(fā)生作用活化半胱天冬酶，進(jìn)一步引發(fā)凋亡；對(duì)于內(nèi)源性凋亡，線粒體受損可能會(huì)激活細(xì)胞色素C的釋放，并進(jìn)一步激活半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24-25]。在Pb2+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制中，線粒體途徑被認(rèn)為是介導(dǎo)凋亡的主要方式，Pb2+可以誘導(dǎo)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，破壞線粒體功能，影響線粒體的融合與分離，導(dǎo)致線粒體損傷并最終引發(fā)凋亡[26]。本研究中，流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡水平的分析和凋亡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，Pb2+可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升，而MNPs對(duì)Pb2+的吸附，能夠顯著降低Pb2+通過線粒體途徑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而減少Pb2+對(duì)細(xì)胞的損傷和毒性作用。由于Pb2+導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是Pb2+引起腎臟毒性的重要機(jī)制之一[27]，而少量的細(xì)胞凋亡不破壞整個(gè)組織結(jié)構(gòu)，不引發(fā)炎癥反應(yīng)，能很好地維持器官的功能穩(wěn)定[28-29]，因此，可以通過MNPs對(duì)Pb2+的吸附降低Pb2+導(dǎo)致的腎臟損傷。李專等[19]研究MNPs與Cr6+的復(fù)合物的細(xì)胞毒性時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，即MNPs對(duì)Cr6+的吸附，降低了Cr6+導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，復(fù)合物本身未導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，減弱了對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)濃度和暴露時(shí)間條件下，Pb2+能夠顯著抑制大鼠腎細(xì)胞活性，改變細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞有顯著的毒性作用，并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；在本實(shí)驗(yàn)濃度和暴露時(shí)間下，利用MNPs吸附水環(huán)境中Pb2+形成的復(fù)合物MNPs-Pb對(duì)大鼠腎細(xì)胞沒有顯著的毒性作用，MNPs對(duì)Pb2+的吸附可能是Pb2+的細(xì)胞毒性降低的原因。

急性毒性效應(yīng)反映細(xì)胞短期內(nèi)的損傷情況，但不能確定細(xì)胞長(zhǎng)期的病理變化。本研究選擇了單一濃度的MNPs與不同濃度的Pb2+在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)，而復(fù)合毒性與污染物的濃度范圍、混合配比以及暴露時(shí)間密切相關(guān)，因此，不同濃度、配比的MNPs和Pb2+對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期復(fù)合作用及作用機(jī)理需要進(jìn)一步的研究和確認(rèn)。