刺芒柄花素對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的緩解作用

侯 偉, 萬 躉

(四川省骨科醫(yī)院脊柱科, 成都 610041)

Ⅱ型糖尿病是一種以代謝失衡為特征的疾病，常常伴有多種并發(fā)癥，其中骨質(zhì)疏松已被多數(shù)學(xué)者公認(rèn)。骨質(zhì)疏松是一種以骨結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致骨量降低，使骨組織脆性變強(qiáng)的全身性骨代謝疾病，以絕經(jīng)后女性和老年人多見。目前研究[1]認(rèn)為，骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制主要是由骨吸收與骨形成發(fā)生障礙引起，其病理現(xiàn)象主要是成骨細(xì)胞功能的紊亂，以及破骨細(xì)胞吸收的增強(qiáng)。但針對(duì)Ⅱ型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松尚未找到有效的治療藥物。刺芒柄花素(formononetin)是紅車軸草的主要有效成分，屬于異黃酮類成分。研究[2]證實(shí)，紅車軸草中異黃酮類植物成分表現(xiàn)為類雌激素樣作用。

刺芒柄花素具有多種藥理活性，如抑制腫瘤、抗氧化、抗高血壓及雌激素樣作用，其對(duì)骨質(zhì)疏松有預(yù)防治療的作用，但其是否對(duì)Ⅱ型糖尿病并發(fā)糖尿病骨病大鼠的骨質(zhì)疏松具有緩解作用，以及是否對(duì)骨組織形態(tài)存在影響，目前尚未有研究證明。因此，本研究旨在探究刺芒柄花素對(duì)Ⅱ型糖尿病并發(fā)糖尿病骨病大鼠骨質(zhì)疏松的緩解作用及骨組織形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量270~290 g，9 周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0001]，飼養(yǎng)于四川省骨科醫(yī)院動(dòng)物研究所[SYXK(川)2018-058]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本單位動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20180506)。

1.2 試劑和儀器

刺芒柄花素粉末(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)；睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol,E2)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；TRIzol總RNA 提取試劑(北京艾德萊生物科技有限公司)；HiScript 反轉(zhuǎn)錄酶(南京諾唯贊生物科技有限公司)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司)；山羊多抗CYP24A1(美國Novus 公司)；兔多抗骨鈣素(osteocalcin, OC)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

三諾血糖儀(長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司)；RT-2100C 自動(dòng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)；MDF-382E 型超低溫冰箱(日本Sanyo 公司)；1-15K 型冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；9700 型Gene AmpPCR 儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Discovery-A 型雙能X 線吸收骨密度儀(美國Hologic 公司)。

1.3 造模及分組

60 只大鼠，隨機(jī)取10 只作為對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)；另50 只大鼠進(jìn)行Ⅱ型糖尿病造模，具體方法是用高脂飼料(high fat diet, HFD)喂養(yǎng)。HFD 熱量為21.35 kJ/g，其中來自脂肪的熱量占61.6%，蛋白質(zhì)占18.1%，碳水化合物占20.3%(Test Diet，Richmond，IN，美國)。HFD 連續(xù)喂養(yǎng)4 周后，腹膜內(nèi)注射低劑量的鏈脲佐菌素(STZ)(35 mg/kg)。繼續(xù)HFD 喂養(yǎng)1 周后，禁食12 h，使用市售的血糖儀測(cè)量大鼠空腹血糖水平，血糖水平≥16.7 mmol/L 即造模成功[3]。

50 只大鼠，造模成功45 只，造模成功率為90%。將造模成功的45 只大鼠隨機(jī)抽取15 只作為糖尿病組；另30 只作為給藥組，隨機(jī)分為刺芒柄花素高、中、低劑量組(100 mg/kg、50 mg/kg,20 mg/kg)，每組10 只，每日1 次給予相應(yīng)劑量的刺芒柄花素；對(duì)照組及糖尿病組給予相應(yīng)體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃4 周。

1.4 取材

大鼠經(jīng)麻醉后股動(dòng)脈取血，靜置于分離膠促凝管中30 min 后，3 000 r/min 4 ℃低溫離心10 min，收集血清，-80 ℃保存；處死大鼠后，摘取大鼠腎臟，并迅速剔出各組大鼠大腿雙側(cè)股骨；將股骨周圍多余的軟組織去除，左側(cè)病灶區(qū)股骨迅速放進(jìn)液氮中，3 min 取出；用生理鹽水紗布將右側(cè)股骨包好，在-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 股骨骨密度(BMD)檢測(cè)

造模成功4 周末，采用雙能X 線吸收法檢測(cè)各組大鼠股骨BMD，掃描軟件為小動(dòng)物軟件(版本：3.9.4)，測(cè)量條件：掃描速度60 mm/s，測(cè)定面積0.24 cm2。

1.6 ELISA 檢測(cè)大鼠血清T、E2 水平

根據(jù)試劑盒說明書，檢測(cè)大鼠血清T、E2水平。在96 孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行操作，經(jīng)過顯色后在酶標(biāo)儀內(nèi)以450 nm 波長依序測(cè)量各孔內(nèi)吸光度值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，求得樣品濃度。

1.7 PCR 檢測(cè)

TRIzol 法提取股骨以及腎臟RNA，取溶解后的RNA 2 μL，用微量分光光度計(jì)測(cè)定A260與A280比值為1.8~2，即滿足實(shí)驗(yàn)要求，然后計(jì)算樣品RNA 濃度。在RNA 反轉(zhuǎn)錄酶及RNA 酶抑制劑的作用下，以O(shè)ligo(dT)為引物將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。反轉(zhuǎn)錄完畢后，將cDNA 靜置于-80 ℃冰箱備用。以GAPDH 為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增檢測(cè)樣本中OC 及 CYP24A1 mRNA表達(dá)。擴(kuò)增引物由武漢擎科公司合成，引物序列見表1。PCR 擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40 次循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，繪制溶解曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 刺芒柄花素對(duì)大鼠股骨BMD 的影響

與對(duì)照組大鼠比較，糖尿病組大鼠的BMD降低(P<0.05)；與糖尿病組比較，刺芒柄花素低、中、高劑量組大鼠BMD 均升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠骨密度Figure 1 Bone mineral density of rats in each group

2.2 刺芒柄花素對(duì)大鼠血清T、E2 水平的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病組T、E2水平明顯下降(P<0.05)；與糖尿病組比較，刺芒柄花素各組T、E2水平明顯上升(P<0.05)(表2)。

2.3 刺芒柄花素對(duì)大鼠股骨OC mRNA、腎臟CYP24A1 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病組股骨OC mRNA、腎臟CYP24A1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與糖尿病組比較，刺芒柄花素各組OC mRNA、CYP24A1 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)(表3)。

表2 刺芒柄花素對(duì)大鼠血清 T、E2 水平的影響Table 2 Effect of formononetin on serum T and E2 levels in rats (, n=10)

表2 刺芒柄花素對(duì)大鼠血清 T、E2 水平的影響Table 2 Effect of formononetin on serum T and E2 levels in rats (, n=10)

注: 與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與糖尿病組比較, #P<0.05。

組 別 Tρ/(ng·mL-1) E2ρ/(pg·mL-1)對(duì)照組糖尿病組刺芒柄花素低劑量組刺芒柄花素中劑量組0.33±0.07 0.12±0.03*0.16±0.04#0.24±0.06#0.31±0.09#63.12±0.26 50.33±0.47*52.72±0.33#55.81±0.29#59.22±0.87#刺芒柄花素高劑量組

表3 刺芒柄花素對(duì)大鼠股骨OC mRNA、腎臟 CYP24A1 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effect of formononetin on the expressions of OC mRNA in femur and CYP24A1 mRNA in kidney of rats (, n=10)

表3 刺芒柄花素對(duì)大鼠股骨OC mRNA、腎臟 CYP24A1 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effect of formononetin on the expressions of OC mRNA in femur and CYP24A1 mRNA in kidney of rats (, n=10)

注: 與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與糖尿病組比較, #P<0.05。

組 別 OC CYP24A1對(duì)照組糖尿病組刺芒柄花素低劑量組刺芒柄花素中劑量組1.03±0.17 3.17±0.22*2.93±0.29#2.18±0.16#1.12±0.21#1.07±0.15 2.39±0.19*2.15±0.28#1.88±0.23#1.21±0.13#刺芒柄花素高劑量組

3 討論

糖尿病易導(dǎo)致微血管病變和骨并發(fā)癥，其骨并發(fā)癥主要以骨質(zhì)疏松為主要表現(xiàn)，易導(dǎo)致骨折，甚至致死致殘，嚴(yán)重影響患者生活和生存質(zhì)量。Schwartz 等[4]研究顯示，Ⅱ型糖尿病患者中骨質(zhì)疏松人數(shù)占20%~60%。研究[5]表明，維生素D、性激素和OC 均與骨質(zhì)疏松存在密切關(guān)聯(lián)。其中，人體內(nèi)維生素D 代謝的主要限速酶是25OHD-1α 羥化酶 D，它能夠加速1,25(OH)2D3 在體內(nèi)的代謝過程，降低機(jī)體的維生素D 水平[6]。而維生素D 缺乏會(huì)引起雌激素分泌紊亂[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]表明，維生素D 缺乏模型小鼠伴有T、E2、促黃體生成素等性激素水平的紊亂。性激素分泌紊亂會(huì)影響機(jī)體內(nèi)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的平衡，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥屬于“骨萎”、“骨痹”的范疇，發(fā)病原因多與氣血津液不足、脾胃運(yùn)化失調(diào)、腎中精氣虧虛以及體虛勞倦過度有關(guān)[9]。臨床觀察[10]表明，骨質(zhì)疏松癥腎虛量化評(píng)分與血清E2水平存在明顯的負(fù)相關(guān)。O C 是一種由成骨細(xì)胞分泌合成，具有生物學(xué)活性的多肽，為衡量成骨細(xì)胞活躍程度的重要指標(biāo)之一，受維生素D 及維生素K水平等因素的調(diào)控。有學(xué)者[11]提示，OC 不僅能清晰地反映患者的骨代謝情況，還能完整地評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用。去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠接受槲皮素治療4 個(gè)月后，骨質(zhì)疏松情況好轉(zhuǎn)，血清OC 水平顯著下降[12]。國內(nèi)另外一項(xiàng)金天格膠囊對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的研究[13]也佐證了此觀點(diǎn)。

研究[14]發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型糖尿病患者的骨量減少，BMD 下降。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠BMD 顯著下降，而刺芒柄花素能夠改善Ⅱ型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠的BMD，升高血清T、E2水平，抑制骨OC mRNA表達(dá)。這可能與當(dāng)歸補(bǔ)血湯降低維生素D 限速酶CYP24A1 mRNA 的表達(dá)水平，維持機(jī)體內(nèi)維生素D 水平有關(guān)。

綜上，刺芒柄花素可能是通過影響維生素D限速酶CYP24A1表達(dá)，干預(yù) OC 及性激素水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用，但其具體的分子作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。