小麥Pinb基因啟動(dòng)子區(qū)CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建

張淑娟 張榮志 宋國(guó)琦 李玉蓮 高潔 李瑋 高世慶 李根英

摘要：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟并在多種植物中得到成功應(yīng)用，促進(jìn)了基因功能的研究。小麥籽粒硬度是決定小麥加工品質(zhì)的重要性狀，Pinb是控制籽粒硬度的關(guān)鍵基因之一。本研究以小麥Pinb基因?yàn)閷?duì)象，聯(lián)合采用常規(guī)PCR和Golden Gate cloning技術(shù)，構(gòu)建了包含小麥Pinb基因啟動(dòng)子區(qū)雙靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因編輯載體。將重組載體轉(zhuǎn)入小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行sgRNA活性的檢測(cè)，在兩個(gè)靶點(diǎn)位置均發(fā)生了突變，編輯效率分別為4.57%和4.37%，基因編輯類型包括堿基替換和堿基缺失。該研究為在小麥中實(shí)現(xiàn)Pinb基因的定點(diǎn)突變奠定了基礎(chǔ)，對(duì)其功能研究和小麥品質(zhì)改良均具有重要意義。

關(guān)鍵詞：小麥;CRISPR/Cas9;基因編輯;Pinb基因

中圖分類號(hào)：S512.103.53：Q782 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）01-0001-09

Abstract The genome editing technology system mediated by CRISPR/Cas9 has ripen and successfully applied in many plants， which promotes the study of gene function. Hardness of wheat grain is an important trait for determining the quality of wheat processing. The Pinb gene is one of the key genes controlling grain hardness. In the study， we chose the Pinb gene of wheat as research object， and constructed a CRISPR/Cas9 genome editing vector containing dual targets in the Pinb gene promoter region of wheat by conventional PCR and Golden Gate cloning technology. Then we transferred the recombinant vector into wheat protoplast and detected the activity of sgRNA. We found the dual targets position had mutated， and the gene editing types included base substitution and base deletion， and the corresponding editing efficiencies were 4.57% and 4.37%， respectively. The results laid the foundation for realizing the site-directed mutagenesis of the Pinb gene， which was of great significance for the functional study of Pinb gene and the improvement of wheat quality.

Keywords Wheat; CRISPR/Cas9; Gene editing; Pinb gene

CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9）作為一種新興的基因編輯系統(tǒng)，具有載體構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單、靶向特異性高、可以多處打靶等特點(diǎn)，在基因功能研究方面逐漸成熟并成功應(yīng)用于多種動(dòng)植物。其原理是crRNA與tracrRNA通過堿基配對(duì)結(jié)合形成crRNA/tracrRNA復(fù)合體（可以人工設(shè)計(jì)改造這兩種RNA，形成單個(gè)具有引導(dǎo)作用的sgRNA），引導(dǎo)Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)靶位點(diǎn)處形成雙鏈斷裂（double-stranded DNA breaks，DSBs），之后細(xì)胞可以通過非同源性末端接合（non-homologous end jouning，NHEJ）修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因組特定位點(diǎn)的DNA插入、缺失、堿基突變或修飾，從而使基因發(fā)生移碼突變。另外，還可以通過同源重組等方式進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯。

目前植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)日趨完善，已經(jīng)在多個(gè)物種中成功實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯，除在擬南芥[1，2]、煙草[1，3]等模式植物上獲得成功，在水稻[4-8]、大豆[9-11]、高粱[1]、玉米[12-15]、番茄[16]、大麥[17]、甜橙[18]、西瓜[19]、葡萄[20]、小麥[21-24]等農(nóng)作物上也成功實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9的應(yīng)用。普通小麥 （Triticum aestivum L.） 是世界上種植面積最廣的作物之一，具有非常復(fù)雜的多倍體基因組（17 Gb）和高比例的重復(fù)序列（>80%），為小麥遺傳和功能分析帶來(lái)了挑戰(zhàn)。目前，在普通小麥中只有少數(shù)使用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯的報(bào)道。由CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得的TaMLO突變體具有對(duì)白粉病的廣譜抗性[22]。 Zhang等[25]將CRISPR/Cas9編輯方法用于六倍體面包小麥和四倍體硬粒小麥，產(chǎn)生的突變體沒有任何可檢出的轉(zhuǎn)基因。Zhang等[26]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)敲除小麥EDR1基因的三個(gè)同源基因，獲得的植株對(duì)白粉病具有很好的抗性。另外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以有效地減少小麥籽粒中α-醇溶蛋白含量，從而為谷蛋白不耐受的消費(fèi)者提供特殊面包和硬質(zhì)小麥系列[23]。

籽粒硬度（grain hardness）是重要的小麥品質(zhì)性狀之一，對(duì)谷物加工品質(zhì)具有重要影響。小麥籽粒硬度主要由位于5D染色體短臂上的2個(gè)主效基因Pina（Puroindoline a）和Pinb（Puroindoline b）調(diào)控，并受Gsp-1基因（Grain Softness Protein）的影響。Pina和Pinb緊密連鎖，編碼區(qū)均為447 bp，沒有內(nèi)含子，共同形成小麥籽粒硬度的分子遺傳基礎(chǔ)。Pina和Pinb基因的突變或缺失均會(huì)引起小麥胚乳質(zhì)地的硬度增加。盡管二倍體小麥祖先種A和B中存在Pina和Pinb基因，但是四倍體馴化小麥中卻不存在這兩個(gè)基因，所以表現(xiàn)出硬粒表型。而六倍體小麥由于D組的加入，重新獲得了Pina和Pinb，故而表現(xiàn)出籽粒硬度的多樣性。所以小麥的硬度基因位點(diǎn)從一定程度上反映了小麥的進(jìn)化和馴化過程。

目前，關(guān)于小麥硬度基因表達(dá)調(diào)控的研究較少。小麥Pina和Pinb基因的啟動(dòng)子已經(jīng)分離出來(lái)，且有關(guān)于啟動(dòng)子組成的分析，但是在啟動(dòng)子調(diào)控方面并沒有相關(guān)數(shù)據(jù)。使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯農(nóng)作物相關(guān)基因的啟動(dòng)子，可對(duì)作物數(shù)量性狀產(chǎn)生微妙的影響。Rodriguez-Leal等[27]利用CRISPR/Cas9體系改良番茄數(shù)量性狀，通過定點(diǎn)修飾順式調(diào)控序列實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)量性狀的精準(zhǔn)調(diào)控。挖掘和創(chuàng)制順式調(diào)控序列的變異，對(duì)于作物遺傳改良意義重大。

利用CRISPR/Cas9突變相關(guān)基因的啟動(dòng)子而不是這些基因本身，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)數(shù)量性狀的精細(xì)調(diào)節(jié)，微調(diào)基因表達(dá)而不是剔除或滅活它們編碼的蛋白。本研究擬對(duì)TaPinb基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行基因編輯，目的在于進(jìn)一步明確TaPinb基因的功能和其在籽粒質(zhì)地形成中的作用，并為通過基因工程方法快速改良我國(guó)現(xiàn)有小麥優(yōu)良品種的籽粒硬度提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物CRISPR/Cas9基因編輯載體為pYLCRISPR/Cas9PubiB，GenBank登錄號(hào)為KR029110.1，它是在雙元載體pCAMBIA1300（AF234296）的基礎(chǔ)上改造而來(lái)的，Cas9p模擬了禾本科植物基因具有5′端GC含量較高的特征，是設(shè)計(jì)合成的植物優(yōu)化密碼子基因。sgRNA的載體pYPQ131D-TaU6和pYPQ132C-TaU6是CRISPR/Cas9基因編輯載體的中間載體，均含有小麥U6啟動(dòng)子TaU6，用以啟動(dòng)sgRNA。以上質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

T4連接酶、DNA Marker DL2000等試劑購(gòu)自TaKaRa公司;FastPfu、2×Taq Mix、DH5α等購(gòu)自北京全式金公司;限制性內(nèi)切酶BgⅢ、BsmBⅠ等購(gòu)自Fermentas公司;BsaⅠ-HF購(gòu)自NEB公司;引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 Pinb基因的擴(kuò)增和sgRNA的選擇 以Pinb-F和Pinb-R為引物，以小麥品種Fielder的基因組DNA為模板，用高保真酶擴(kuò)增Pinb基因，PCR體系為：5×buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，加水補(bǔ)齊至50 μL。程序?yàn)椋?5℃ 2 min;95℃ 20 s，56℃ 50 s，72℃ 30 s，33個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。電泳切膠回收，連接載體，送測(cè)序公司測(cè)序。

通過網(wǎng)站CRISPRdirect （http：//crispr.dbcls.jp/）在TaPinb基因ATG前的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)ふ?個(gè)適合的打靶位點(diǎn)，在PAM結(jié)構(gòu)前選擇合適的序列片段設(shè)定為靶序列，分別為：sgRNA1：5′-ATGTCACTAAGCAATAAATAA-3′;sgRNA2：5′-GGAGATGAATAGATGGGTTG-3′。

1.2.2 sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建方法

（1）線性化克隆載體pYPQ131D、pYPQ132C：使用限制性內(nèi)切酶BgⅢ和BsmBⅠ雙酶切克隆載體pYPQ131D-TaU6、pYPQ132C-TaU6，37℃溫育1 h，電泳后利用DNA回收試劑盒回收3.5 kb的線性化片段，定量后備用。

（2）引物磷酸化退火形成雙鏈：Pinb基因的sgRNA1的引物對(duì)應(yīng)的是Pinb-TaU6-gR1F和Pinb-TaU6-gR1R（表1），sgRNA2的引物對(duì)應(yīng)的是Pinb-TaU6-gR2F和Pinb-TaU6-gR2R（表1），引物中的下劃線堿基部分分別與pYPQ131D和pYPQ132C載體中的序列匹配。分別將sgRNA1和sgRNA2的2條引物進(jìn)行磷酸化，直接退火形成雙鏈，程序在PCR儀中按下列條件運(yùn)行：37℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃/min （0.08℃/s）的速度將溫度降至25℃?；蛘呤欠兴兄? min，之后自然冷卻至室溫。

（3） 連接轉(zhuǎn)化：將上述線性化的克隆載體pYPQ131D、pYPQ132C，和磷酸化后的寡核苷酸鏈sgRNA1和sgRNA2分別在16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α，平板四環(huán)素抗性。之后挑平板單克隆送測(cè)序，驗(yàn)證是否插入，最終得到pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2。

1.2.3 組裝sgRNA表達(dá)盒到pYLCRISPR/Cas9載體

（1）sgRNA表達(dá)盒的擴(kuò)增：以上述試驗(yàn)中獲得的pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2為模板，分別以YL-131D-F和YL-131D-R、YL-132C-F和YL-132C-R為引物，用高保真酶擴(kuò)增TaU6-gR1和TaU6-gR2這2個(gè)表達(dá)盒，PCR體系為：5×buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，加水補(bǔ)齊至50 μL。程序?yàn)椋?5℃ 2 min; 95℃ 20 s，62℃ 20 s，72℃ 30 s，33個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。電泳切膠回收，定量備用。

（2） pYLCRISPR/Cas9載體與sgRNA表達(dá)盒的酶切連接反應(yīng)：利用Golden Gate cloning的方法，將pYPQ131D-sgRNA1和pYPQ132C-sgRNA2這兩個(gè)表達(dá)盒克隆到pYLCRISPR/Cas9載體中。連接用的2個(gè)表達(dá)盒即上述步驟中的TaU6-gR1和TaU6-gR2。酶切連接反應(yīng)體系為：10×Cutsmart Buffer 1 μL ，10 mmol/L ATP 1 μL ，TaU6-gR1 1 μL，TaU6-gR2 1 μL，pYLCRISPR/Cas9Pubi-B 2 μL，BsaⅠ-HF 1 μL，T4 ligase 1 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。用變溫循環(huán)進(jìn)行酶切連接約10～15循環(huán)： 37℃ 5 min， 10℃ 5 min， 20℃ 5 min;最后37℃ 5 min。

（3）連接轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后于LB（Kan）平板上培養(yǎng)至克隆長(zhǎng)出后，挑單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定及測(cè)序。引物用的是SP-L1和SP-R。

1.3 小麥原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化

參照文獻(xiàn)[28]的小麥原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化方法并適當(dāng)調(diào)整。種子在25℃（16L/8D）培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)7～10 d。取15～20片新鮮葉片用手術(shù)刀片切成0.5～1.0 mm寬的細(xì)條并轉(zhuǎn)移到10 mL酶解液（1.5%纖維素酶R10，0.75%離析酶，0.6 mol/L甘露醇，20 mmol/L MES，10 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA）。將酶解液和葉條置于50 r/min搖床上，用錫箔紙包裹在黑暗條件下酶解6 h。酶解后，加入等體積W5（2 mmol/L MES， 154 mmol/L NaCl， 125 mmol/L CaCl2， 5 mmol/L KCl） 輕柔搖晃釋放出原生質(zhì)體，清洗3次。用70 μm的細(xì)胞網(wǎng)篩過濾酶解液，用50 mL圓底離心管收集濾液。加入MMG溶液重懸（0.4 mol/L mannitol， 15 mmol/L MgCl2， 4 mmol/L MES）。將構(gòu)建好的質(zhì)粒利用PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化入原生質(zhì)體。最后，黑暗或者弱光下25℃培養(yǎng)原生質(zhì)體2～3 d。離心后收集小麥原生質(zhì)體，用DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 基因編輯結(jié)果檢測(cè)

使用特異性引物對(duì)靶位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。將正向和反向的Barcode分別添加到PCR引物的5′端用于文庫(kù)構(gòu)建（引物為表1中的PF和PR，下劃線為Barcode）。通過具有相應(yīng)Barcode的引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于Pinb基因2個(gè)靶位點(diǎn)的區(qū)域。擴(kuò)增后，將等量的PCR產(chǎn)物混合，按照German等[29]的方法構(gòu)建2×150 bp paired-end 文庫(kù)，用于諾禾致源公司進(jìn)行Illumina測(cè)序。在靶基因的靶向位點(diǎn)處發(fā)生的InDel（包括替換、插入和缺失）被認(rèn)為是突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向TaPinb的sgRNA設(shè)計(jì)

從小麥品種Fielder里擴(kuò)增TaPinb基因的序列，擴(kuò)增序列見圖1，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因序藍(lán)色代表TaPinb基因的編碼區(qū)，下劃線標(biāo)記序列為靶向TaPinb基因的兩個(gè)sgRNA序列。

圖1 TaPinb基因及sgRNA序列列100%相似。TaPinb基因全長(zhǎng)447個(gè)堿基，沒有內(nèi)含子，應(yīng)用軟件CRISPRdirect在TaPinb基因ATG前的啟動(dòng)子區(qū)域找到兩個(gè)合適的sgRNA，分別為：sgRNA1：5′-ATGTCACTAAGCAATAAATAA-3′;sgRNA2：5′-GGAGATGAATAGATGGGTTG-3′。

2.2 sgRNA連接到pYPQ31D和pYPQ132C

分別將sgRNA1和sgRNA2的2條引物進(jìn)行磷酸化，直接退火形成雙鏈，然后分別與用限制性內(nèi)切酶BgⅢ和BsmBⅠ雙酶切后的克隆載體pYPQ131D-TaU6、pYPQ132C-TaU6連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序結(jié)果見圖2。

2.3 TaPinb的sgRNA表達(dá)盒的擴(kuò)增

以pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2為模板，分別以YL-131D-F和YL-131D-R、YL-132C-F和YL-132C-R為引物，用高保真酶擴(kuò)增TaU6-gR1和TaU6-gR2這2個(gè)表達(dá)盒，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為571 bp（圖3）。

2.4 sgRNA表達(dá)盒和Cas9雙元表達(dá)載體的組合

我們應(yīng)用Golden Gate cloning技術(shù)，一步完成sgRNA表達(dá)盒的拼接及與Cas9雙元表達(dá)載體的組合，從而獲得CRISPR/Cas9編輯載體（圖4）。如圖5所示，用SP-L1和SP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見約1.5 kb的條帶，包括2個(gè)sgRNA表達(dá)盒的大?。═aU6-sgRNA），與預(yù)期相符，而對(duì)照pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達(dá)載體擴(kuò)增出的條帶是ccdB，約657 bp，這說(shuō)明sgRNA1和sgRNA2表達(dá)盒已經(jīng)組裝進(jìn)入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達(dá)載體，獲得了TaPinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TaPinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體是否構(gòu)建成功，我們將獲得的質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，引物用的是SP-L1和SP-R，結(jié)果檢測(cè)到了2個(gè)sgRNA的靶序列，同時(shí)在靶序列上游都檢測(cè)到了TaU6啟動(dòng)子序列，說(shuō)明sgRNA1和sgRNA2表達(dá)盒構(gòu)建成功，并成功地組裝進(jìn)入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達(dá)載體，證明了Pinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建成功（圖6）。

采用PEG法轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，將轉(zhuǎn)化后孵育2～3 d的小麥原生質(zhì)體用植物基因組DNA提取試劑盒提取小麥基因組DNA，對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后建庫(kù)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明目標(biāo)的編輯類型主要是SNP和InDel。其中，Pinb-gR1位點(diǎn)具有4.57%的突變效率，包括4.49%的SNP和0.08%的InDel。Pinb-gR2位點(diǎn)的突變效率4.37%，包括4.05%的SNP和0.33%的InDel（表2）。Pinb-gR1突變位點(diǎn)檢測(cè)（圖7a）發(fā)現(xiàn)編輯位點(diǎn)（PAM序列前第4位）處有堿基的替換和缺失，包括單堿基的替換、單堿基的缺失以及4個(gè)堿基的缺失。Pinb-gR2突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見圖7b，突變類型主要是單堿基替換和缺失，另外，在PAM前的其它位點(diǎn)也檢測(cè)到了突變。

3 討論與結(jié)論

普通小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植面積最廣的作物之一，籽粒硬度是決定小麥加工品質(zhì)最重要的性狀之一，對(duì)小麥出粉率、淀粉損傷和生面粉團(tuán)的吸水性都具有較大影響。因此Pin基因的功能研究和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用對(duì)小麥品質(zhì)改良理論與實(shí)踐具有重要意義，為進(jìn)一步研究小麥中Pin基因在影響籽粒硬度的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為選育優(yōu)質(zhì)專用小麥提供種質(zhì)資源。

基因敲除是研究基因功能最簡(jiǎn)單的方法之一。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)基因組產(chǎn)生雙鏈斷裂，通過細(xì)胞自身的NHEJ修復(fù)途徑造成若干堿基的插入、缺失和替換，從而造成基因的移碼突變，起到基因敲除的作用。目前植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)已日趨完善，已經(jīng)在多種植物中成功實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯。

為了探索CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于小麥基因組編輯的效率和特異性，本研究針對(duì)Pinb基因的啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA。本載體系統(tǒng)可采用Golden Gate cloning技術(shù)[30]， 其原理是利用BsaⅠ（type Ⅱs restriction enzyme）的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不重疊的特性，可以設(shè)計(jì)出多種不同的且非回文結(jié)構(gòu)的粘性末端。多個(gè)要連接的片段在連接點(diǎn)具有特異的互補(bǔ)末端可以連接，而非連接點(diǎn)的末端之間不互補(bǔ)不能連接（相同末端分子間也不互補(bǔ)不能連接），因此連接反應(yīng)是向著目標(biāo)單方向進(jìn)行，效率很高。

我們通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入小麥的原生質(zhì)體，Illumina測(cè)序結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行了Pinb基因編輯。在兩個(gè)靶位點(diǎn)均檢測(cè)到了堿基的突變，編輯效率分別為4.57%和4.37%，其中多數(shù)情況是堿基替換，少數(shù)情況是堿基的刪除。另外，在小麥原生質(zhì)體編輯情況檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)除了PAM序列前第四個(gè)堿基處發(fā)生突變外，在gRNA靶標(biāo)區(qū)域的其它堿基處也發(fā)現(xiàn)了一些突變，這可能是由于原生質(zhì)體DNA制備過程有損傷，導(dǎo)致測(cè)序出現(xiàn)個(gè)別堿基的差異。有研究表明CRISPR/Cas9的特異性僅與gRNA配對(duì)的靠近PAM處7～12 bp堿基相關(guān)，其它堿基的突變是否與Cas9的特異性有關(guān)也需要在轉(zhuǎn)基因小麥中進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過PEG介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9基因編輯載體轉(zhuǎn)入小麥原生質(zhì)體，利用高通量測(cè)序檢測(cè)到了靶標(biāo)基因的編輯，證明該載體可以應(yīng)用于小麥的基因組編輯，從而為應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得小麥基因組編輯植株打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前我們正在將這個(gè)載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化，下一步將會(huì)在轉(zhuǎn)基因小麥植株中檢測(cè)編輯類型。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Jiang W， Zhou H， Bi H， et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis， tobacco， sorghum and rice [J]. Nucleic Acids Res.， 2013， 41（20）：e188.

[2] Li J F， Norville J E， Aach J， et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9 [J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31（8）：688-691.

[3] Nekrasov V， Staskawicz B， Weigel D， et al. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease [J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31（8）：691-693.

[4] Zhang H， Zhang J， Wei P， et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation [J]. Plant Biotechnol. J.， 2014， 12（6）：797-807.

[5] Zhou H， Liu B， Weeks D P， et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice [J]. Nucleic Acids Res.， 2014， 42（17）：10903-10914.

[6] Ma X， Zhang Q， Zhu Q， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants [J]. Mol. Plant， 2015， 8（8）：1274-1284.

[7] Xu K， Ren C， Liu Z， et al. Efficient genome engineering in eukaryotes using Cas9 from Streptococcus thermophilus[J]. Cell Mol. Life Sci.， 2015， 72（2）：383-399.

[8] Li J， Sun Y， Du J， et al. Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system [J]. Mol. Plant， 2017， 10（3）：526-529.

[9] Jacobs T B， LaFayette P R， Schmitz R J， et al. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9 [J]. BMC Biotechnol.， 2015， 15：16.

[10] Sun X， Hu Z， Chen R， et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system [J]. Sci. Rep.， 2015， 5：10342.

[11] Tang F， Yang S， Liu J， et al. Rj4， a gene controlling nodulation specificity in soybeans， encodes a thaumatin-like protein but not the one previously reported [J]. Plant Physiol.， 2016， 170（1）：26-32.

[12] Liang Z， Zhang K， Chen K， et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system [J]. J. Genet. Genomics， 2014， 41（2）：63-68.

[13] Xing H L， Dong L， Wang Z P， et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants [J]. BMC Plant Biol.， 2014， 14：327.

[14] Svitashev S， Young J K， Schwartz C， et al. Targeted mutagenesis， precise gene editing， and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA [J]. Plant Physiol.， 2015， 169（2）：931-945.

[15] Char S N， Neelakandan A K， Nahampun H， et al. An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize [J]. Plant Biotechnol. J.， 2017， 15（2）：257-268.

[16] Brooks C， Nekrasov V， Lippman Z B， et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system [J]. Plant Physiol.， 2014， 166（3）：1292-1297.

[17] Lawrenson T， Shorinola O， Stacey N， et al. Induction of targeted， heritable mutations in barley and Brassica oleracea using RNA-guided Cas9 nuclease [J]. Genome Biol.， 2015， 16：258.

[18] Jia H， Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA [J]. PLoS ONE， 2014， 9（4）：e93806.

[19] Tian S， Jiang L， Gao Q， et al. Efficient CRISPR/Cas9-based gene knockout in watermelon [J]. Plant Cell Rep.， 2017， 36（3）：399-406.

[20] Wang X， Tu M， Wang D， et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation [J]. Plant Biotechnol. J.， 2017.

[21] Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system [J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31（8）：686-688.

[22] Wang Y， Cheng X， Shan Q， et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew [J]. Nat. Biotechnol.， 2014， 32（9）：947-951.

[23] Snchez-León S， Gil-Humanes J， Ozuna C V， et al. Low-gluten， nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9 [J]. Plant Biotechnol. J.， 2018， 16（4）：902-910.

[24] Kim D， Alptekin B， Budak H. CRISPR/Cas9 genome editing in wheat [J]. Funct. Integr. Genomics， 2018， 18（1）：31-41.

[25] Zhang Y， Liang Z， Zong Y， et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA [J]. Nat. Commun.， 2016， 7：12617.

[26] Zhang Y， Bai Y， Wu G， et al. Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat [J]. Plant J.， 2017， 91（4）：714-724.

[27] Rodriguez-Leal D， Lemmon Z H， Man J， et al. Engineering quantitative trait variation for crop improvement by genome editing [J]. Cell， 2017， 171（2）：470-480.

[28] Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system [J]. Nat. Protoc.， 2014， 9（10）：2395-2410.

[29] German M A， Luo S， Schroth G， et al. Construction of Parallel Analysis of RNA Ends （PARE） libraries for the study of cleaved miRNA targets and the RNA degradome [J]. Nat. Protoc.， 2009， 4（3）：356-362.

[30] Engler C， Kandzia R， Marillonnet S. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability [J]. PLoS ONE， 2008， 3（11）：e3647.