李宗瑾 宋長新

摘要：肺動脈高壓（pulmonary arterialhypertension，PAH）是一種嚴重的心血管疾病，發(fā)病機制復雜，分子機制尚未完全闡明，臨床死亡率僅次于腫瘤與心肌梗死，嚴重威脅人類的生命健康。因此，需要更多的方法來探究PAH的分子機制，挖掘影響其發(fā)生的關鍵因子。該文將PAH疾病的分子研究與加權基因共表達網絡（WGCNA）相結合，通過構建PAH加權基因共表達網絡，探討其潛在生物標志物，篩選可能與PAH顯著相關的關鍵基因，為PAH的預防及早期治療提供理論與實踐基礎。

關鍵詞：PAN;WGCNA;關鍵基因;生物標志物

中圖分類號：TP391文獻標識碼：A

文章編號：1009-3044（2020）15-0008-02

1背景

PAH是一種病因不明、受遺傳與環(huán)境等多因素共同影響的綜合征。其特征是肺動脈壓力和血管阻力增加導致右心衰竭和死亡，診斷后平均生存時間為2.8年。近年來，隨著對PAH發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現遺傳因素在其發(fā)病中起著重要作用。目前，仍存在治療難度大、藥物敏感性低及預后極差的問題，因此需要更多方法來發(fā)現潛在的關鍵（樞紐）基因，進而揭示其分子機制，進而降低其死亡率。WGCNA是一種系統(tǒng)生物學方法，是以基因間表達相似性為基礎來實現基因網絡構建的算法，常用來探索基因和表型之間復雜關系，不僅可以篩選具有價值的生物標志物或靶位點的鑒定，還具有揭示生物學規(guī)律、疾病關鍵驅動因子和藥物作用機理的功能。在本研究中，我們利用GEO數據庫中的PAH表達譜數據構建了加權基因共表達網絡，篩選可能影響PAH疾病發(fā)生的關鍵因子，為實現PAH的早期預防與及時治療提供理論基礎。

2材料與方法

2.1數據來源及數據預處理

本文的PAH基因表達譜數據fGSEll7261）來自GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，），包含25個正常人類樣本，和58個PAH樣本，平臺為GPL6244。本研究使用R編程語言（v3.6.2），Bioconductor軟件包和WGCNA軟件包進行數據分析。

2.2共表達網絡的構建和模塊構建

我們使用R中的WGCNA軟件包來構建PAH加權基因共表達網絡。首先，計算所有基因對的相關性構建Pearson相關矩陣，如公式（1）。然后，使用冪函數nil=Allg將相關矩陣轉換為鄰接矩陣，其中β是一個可以強調強相關性的軟閾值，軟閾值p可以使網絡符合標準的無尺度網絡，從而實現無標度拓撲。第三，將鄰接矩陣轉換為拓撲重疊矩陣（TOM），如公式（2），并計算基因間相異度矩陣dissTOM=1-TOM，對dissTOM層次聚類得到系統(tǒng)聚類樹，即將具有相似表達的基因分為同簇。第四，通過dynamic Tree Cut動態(tài)剪枝算法來區(qū)分共表達模塊，其中min-ModuleSize為50，deepSplit為2，其他參數設置為默認值，并計算代特征向量值（ME），通過聚類合并具有高度相似的模塊，便可得到基因模塊。

其中，Bij表示基因i和基因j之間的鄰接系數;lij表示基因i與基因i所有共同相鄰基因的鄰接系數的乘積之和;ki代表基因i與所有相鄰節(jié)點的鄰接系數綜合。若值為0，表示這兩個基因都是孤立的。若值是1，表示這兩個基因與所有基因都是相鄰的。

2.3篩選共表達網絡關鍵模塊

本文將使用兩種方法來鑒別與高血壓相關的模塊。第一種方法，計算各模塊的模塊特征基因（module eigengene，ME）與疾病性狀皮爾森相關系數及其P值來確定關鍵模塊;第二種方法，通過計算基因顯著性（Gene Significance，GS）和模塊顯著性（Module Significance，MS）來確定關鍵模塊。GS是指基因的表達量與某一臨床信息的皮爾森相關系數，MS是指模塊中所有基因的GS的平均值。一般所有模塊MS與GS的絕對值越大，說明與PAH疾病越相關。

2.4鑒定關鍵模塊的樞紐基因

模塊的樞紐基因是與疾病最緊密相關的基因，通常具有更大的生物學意義。Gs表示了基因在各種網絡中的重要性，模塊身份（Modularmembership，MM）用來衡量基因在模塊內的重要性，基因之間的權重顯著性p.weighted可以通過WGCNA包中的networkScrenningO函數計算得到。為了鑒定出更加可靠的關鍵基因，我們再次采用網絡的最大集團度（MCC），如公式（3）。篩選關鍵模塊中的樞紐基因，最后將兩種方法的共同基因作為關鍵基因。

3結果

3.1芯片數據預處理

我們使用R軟件和limma軟件包對數據進行校正批處理、去除空探針及重復基因。根據映射的探針確定了每個基因的表達值，如果多個探針映射到同一基因，則最大值表達值用于表示該基因的表達水平。最后，獲得了20359個基因的表達譜。對表達譜矩陣進行標準差（sD）排序，選取前5000個基因作為共表達網絡構建的輸人數據，進行聚類分析，發(fā)現去除離群樣本GSM3290090。

3.2并加權共表達網絡的構建

軟閾值的選擇是構建WGCNA的關鍵。我們對從1到20的閾值進行了網絡拓撲分析，發(fā)現當B=6時，滿足無標度網絡條件。通過層次聚類將具有相似表達的基因分組為同一模塊，同時將切割線MEDissThres設置為0.2來合并模塊，鑒定了17個基因模塊。

3.3確定關鍵基因模塊

我們通過第一種方法得到從模塊purple和pink與PAH相-關性系數分別為-0.77，0.64，其絕對值大于其他模塊的相關系數（圖1），且P值都小于0.01，因此推斷這兩個模塊與PAH最相關，且分別與PAH在顯著的負相關和正相關，即前者模塊中的基因可能抑制PAH的發(fā)生，后者可能促進PAH的發(fā)生。為保證關鍵模塊篩選的準確性，我們用另一種方法重新篩選關鍵模塊，結果表明purple和pink模塊的GS絕對值最大（圖2）。用上述兩種不同方法篩選結果相同，因此purple和pink模塊為關鍵模塊。

3.4與PAH發(fā)生相關的樞紐基因

在本研究中，首先以|MM|>0.8、|GS|>0.2和p.weighted<0.05為標準進行篩選，分別在purple和pink模塊中篩選出了24個和21個樞紐基因。然后將關鍵模塊基因文件導人Cyto-scape，通過MCC算法分別獲得toplO樞紐基因，將兩個方法獲得基因取交集，最終在purple模塊中確定了7個關鍵基因（TLR1，AQP9，SIGLEC9，LRRC25，LILRA6，LILRB3，S100A9），在pink模塊中確定了5個關鍵基因（ANTXRl，UACA，ECM2，RBFOX2，NREP）。

4討論

在這項研究中，我們使用WGCNA構建PAH的基因共表達網絡，目的是尋找新的和關鍵的生物標志物。在WGCNA中，動態(tài)樹切割共識別了17個基因模塊，其中purple和pink模塊是與PAH高度相關的兩個模塊。然后篩選了12個與PAH相關的潛在樞紐基因，即TLRl、AQP9、SIGLEC9、LRRC25、LILRA6、HLRB3、S100A9、ANTXRl、UACA、ECM2、RBFOX2、NREP。其中，前七個關鍵基因與PAH呈負相關，可能抑制PAH的發(fā)生，后五個關鍵基因與PAH呈正相關，可能誘發(fā)PAH的發(fā)生。

通過查詢文獻及基因數據庫，發(fā)現有三個關鍵基因（TLRl、AQP9和RBFOX21已經有研究表明與PAH或高血壓相關，如Koupenova M等人發(fā)現不同性別的血小板TLR轉錄物與不同的心血管危險因素和循環(huán)炎癥水平相關;AQP9在內皮細胞，血管平滑肌細胞和心血管系統(tǒng)心臟中表達，參與心血管功能和相關疾病的病理過程;Zhou Y等人研究發(fā)現RBFOX2在高血壓中起關鍵作用。有四個關鍵（sIGLEC9、ANTXRl、LRRC25和ECM21雖然還未有報道其與PAH相關，但其對血管具有調節(jié)作用或與TGT-β相關。其余五個關鍵基因（LILRA6、LILRB3、S100A9、UACA和NREPl調控參與腫瘤的免疫反應、胰島素抵抗/2糖尿病、調節(jié)細胞凋亡、腎纖維化的新靶標等。表明我們的研究可以篩選出具有生物學意義的PAH關鍵基因。這些發(fā)現有助于更好地了解PAH的發(fā)病的機制，為臨床決策提供預后生物標志物。