祁奇墨　孟凡志　國靜　邢廣萍　郭先鋒

摘要：開展芍藥與牡丹遠(yuǎn)緣雜交研究對(duì)于保障我國芍藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究以課題組前期篩選出的4個(gè)結(jié)實(shí)率較高的芍藥品種為母本，以3個(gè)牡丹品種為父本，設(shè)計(jì)12個(gè)雜交組合，以飽滿種子數(shù)、結(jié)實(shí)心皮率、百粒重等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比篩選各雜交組合的結(jié)實(shí)情況。結(jié)果如下：篩選出雜交親和性高的4個(gè)組合，分別為‘紫鳳羽ב月宮燭光、‘紫鳳羽ב層中笑、‘紫鳳羽ב花王、‘矮粉1號(hào)ב層中笑，其每果飽滿種子數(shù)分別為16.50、12.00、9.13、2.57粒，結(jié)實(shí)心皮率分別為52.50%、60.00%、4706%和73.68%。本研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步培育芍藥屬新品種具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：芍藥;牡丹;遠(yuǎn)緣雜交;結(jié)實(shí)特性

中圖分類號(hào)：S682.1+20.36+S567.1+50.351文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）03-0024-05

Abstract The study of distant hybridization between herbaceous peony and tree peony is of great significance for safeguarding the sustainable development of peony industry in China. In the study， twelve distant hybridization combinations were designed with four herbaceous peony cultivars as female parents and three tree peony cultivars as male parents. The seed-setting characteristics were compared according to the parameters such as the number of full seeds， ratio of fertile carpels and 100-seed weight. The results showed that four combinations with high cross compatibility were screened out， including ‘Zi FengyuבYuegong Zhuguang， ‘Zi FengyuבCengzhong Xiao，‘Zi FengyuבHuawang and ‘Aifen 1בCengzhong Xiao. The number of full seeds per follicle of the four combinations were 16.50， 12.00， 9.13 and 2.57， respectively， while the ratio of fertile carpels were 52.50%， 60.00%， 47.06% and 73.68%， respectively. These results would provide significant references for further breeding new varieties in Paeonia.

Keywords Herbaceous peony; Tree peony;Distant hybridization; Seed setting characteristics

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）是芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）的多年生草本植物，是中國的傳統(tǒng)名花，廣泛栽培于園林綠地。芍藥與牡丹雖為同屬植物，但前者為草本，屬于芍藥組[1]，后者為木本，屬于牡丹組，二者間雜交屬于組間的遠(yuǎn)緣雜交，這種組間雜交長期以來被認(rèn)為極具挑戰(zhàn)性[2]。與大多數(shù)植物遠(yuǎn)緣雜交一樣，牡丹與芍藥的遠(yuǎn)緣雜交往往表現(xiàn)出雜交不親和、胚敗育以及雜種不育的特性[3]，而雜交親和性與親本的遺傳型有密切關(guān)系，因此找到適宜的親本或親本組合是雜交成功的關(guān)鍵。目前國內(nèi)對(duì)芍藥結(jié)實(shí)特性尤其是遠(yuǎn)緣雜交方面的研究較少，隨著近些年來國外組間遠(yuǎn)緣雜交的不斷成功[4，5]，我國學(xué)者也開始在芍藥屬組間雜交方面進(jìn)行一些有益的嘗試，例如：張棟通過組間雜交的方式，從48個(gè)雜交組合中收獲1 715粒種子[6];王越嵐以川赤芍作為父本、牡丹作為母本進(jìn)行反交，平均結(jié)實(shí)11.63粒/朵[7]。

本課題組前期通過對(duì)芍藥品種性狀的調(diào)查研究，篩選出4個(gè)結(jié)實(shí)率較高的芍藥品種，并對(duì)芍藥和牡丹的遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)行了試驗(yàn)，收獲了一定數(shù)量的種子。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇‘鳳凰涅槃、‘矮粉1號(hào)、‘迷你、‘紫鳳羽4個(gè)結(jié)實(shí)特性優(yōu)良的芍藥品種為母本，采用3個(gè)具有優(yōu)良性狀的牡丹品種作為父本進(jìn)行人工授粉雜交，調(diào)查分析其結(jié)實(shí)特性，以期探究特定遠(yuǎn)緣雜交對(duì)芍藥結(jié)實(shí)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以本課題組前期篩選出的‘鳳凰涅槃、‘迷你、‘紫鳳羽和‘矮粉1號(hào)4個(gè)結(jié)實(shí)率較高的芍藥品種為母本，以‘層中笑、‘花王和‘月宮燭光3個(gè)牡丹品種為父本，共計(jì)12個(gè)雜交組合。每個(gè)雜交組合授粉25朵花，分別以母本芍藥天然異花授粉為對(duì)照。父母本植株均種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)基地，管理水平良好，植株生長健壯。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 父本花粉采集與萌發(fā)率測(cè)定 在牡丹含苞欲放期采集花粉，陰干，分裝于離心管中，置于4℃冰箱中保存。采用液體培養(yǎng)基（10 g蔗糖+0.1 g硼酸+100 mL蒸餾水）培養(yǎng)花粉并測(cè)定花粉萌發(fā)率[8]。培養(yǎng)條件為25℃，黑暗培養(yǎng)6 h，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)。OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照?；ǚ酃苊劝l(fā)長度大于或等于花粉粒直徑視為花粉萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率=萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%。

1.2.2 人工授粉 2019年5月初，每株選取5朵含苞待放的主蕾花朵，于花藥尚未散粉前去除全部雄蕊，去雄后立即用硫酸紙袋套住花苞。待柱頭大量分泌粘液時(shí)，人工授予父本花粉，經(jīng)常觀察授粉情況，對(duì)授粉效果較差的花朵進(jìn)行補(bǔ)授。授粉后立即套好硫酸紙袋，并注明雜交組合、授粉時(shí)間等信息。授粉后約7 d時(shí)，摘除硫酸紙袋，避免雌蕊霉?fàn)€。

1.2.3 雜交結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì) 2019年8月上旬于芍藥蓇葖果稍稍開裂、種子尚未脫落時(shí)，收獲蓇葖果。分別統(tǒng)計(jì)和計(jì)算如下指標(biāo)：蓇葖果重量（g）、心皮數(shù)（個(gè)/蓇葖果）、結(jié)實(shí)心皮數(shù)（個(gè)/蓇葖果）、飽滿種子數(shù)（粒/蓇葖果）、不飽滿種子數(shù)（粒/蓇葖果）、每心皮種子數(shù)（粒）、百粒重（g）、結(jié)實(shí)胚珠率（%）和結(jié)實(shí)心皮率（%）。其中，結(jié)實(shí)心皮率（%）=結(jié)實(shí)心皮數(shù)/蓇葖果心皮數(shù)×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0、Microsoft Excel和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 父本花粉的萌發(fā)特性

對(duì)采集的‘層中笑、‘花王和‘月宮燭光3個(gè)牡丹品種的花粉進(jìn)行萌發(fā)率測(cè)定，結(jié)果顯示：‘層中笑和 ‘花王花粉萌發(fā)率高達(dá)近90%，‘月宮燭光花粉萌發(fā)率較低，為65.57%（圖1）。3個(gè)牡丹品種的花粉萌發(fā)率均高于60%，適宜作為父本進(jìn)行雜交授粉試驗(yàn)[8]。

2.2 母本的自然結(jié)實(shí)特性

4個(gè)母本芍藥品種自然授粉情況下的結(jié)實(shí)特征見表1，可以看出：4個(gè)芍藥品種的心皮數(shù)具有差異，‘迷你最多，平均為6個(gè);其次為‘鳳凰涅槃和‘紫鳳羽，為5個(gè)，‘矮粉1號(hào)為4個(gè)。結(jié)實(shí)后，蓇葖果重量、結(jié)實(shí)心皮率、飽滿種子數(shù)、每心皮種子數(shù)、結(jié)實(shí)胚珠率都是衡量結(jié)實(shí)特性的重要指標(biāo)，據(jù)此，‘鳳凰涅槃最優(yōu)，其次為‘迷你，二者均明顯優(yōu)于另外2個(gè)母本品種。百粒重是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，4個(gè)品種間比較，‘鳳凰涅槃>‘矮粉1號(hào) >‘紫鳳羽>‘迷你。綜合來看，‘鳳凰涅槃的自然結(jié)實(shí)性狀最優(yōu)。

2.3 不同雜交組合的結(jié)實(shí)特性

不同雜交組合收獲的飽滿種子數(shù)見圖2，從中可知，以 ‘紫鳳羽為母本收獲種子數(shù)最多，共118粒;其次為以‘矮粉1號(hào)為母本，共收獲種子19粒;以‘迷你和‘鳳凰涅槃為母本收獲種子數(shù)很少，尤其以‘鳳凰涅槃為母本，僅‘鳳凰涅槃ב花王組合收獲1粒種子。各雜交組合中，‘紫鳳羽ב花王組合收獲的種子數(shù)最多，達(dá)到73粒;‘紫鳳羽ב月宮燭光組合收獲種子數(shù)也較多，為33粒;‘矮粉1號(hào)ב層中笑、‘紫鳳羽ב層中笑組合分別為18粒和12粒;其余組合均少于3粒或沒有飽滿種子。

由表2可見，雜交組合‘紫鳳羽ב花王的結(jié)實(shí)蓇葖果數(shù)最多（8個(gè)），雖其每果不飽滿種子數(shù)也最多，但每果仍約有9粒飽滿種子，因此其收獲的飽滿種子最多。‘矮粉1號(hào)ב層中笑的結(jié)實(shí)蓇葖果數(shù)也較多（6個(gè)），但其每果飽滿種子數(shù)平均僅2.57粒，因此該雜交組合收獲的飽滿種子數(shù)較少。而‘紫鳳羽ב月宮燭光雖僅有2個(gè)結(jié)實(shí)蓇葖果，但其每果飽滿種子數(shù)最多，達(dá)到平均16.50粒，最終該組合收獲的飽滿種子數(shù)明顯多于‘矮粉1號(hào)ב層中笑組合。根據(jù)百粒重，‘紫鳳羽為母本的3個(gè)定向雜交組合均高于其自然結(jié)實(shí)，而‘矮粉1號(hào)為母本的雜交組合‘矮粉1號(hào)ב層中笑百粒重略低于‘矮粉1號(hào)自然結(jié)實(shí)百粒重。每果結(jié)實(shí)心皮率，4個(gè)較優(yōu)的雜交組合為 ‘矮粉1號(hào)ב層中笑（7368%）、‘紫鳳羽ב層中笑（60.00%）、‘紫鳳羽ב月宮燭光（52.50%）、‘紫鳳羽ב花王（47.06%）。

2.4 芍藥與牡丹雜交種子發(fā)育觀測(cè)

根據(jù)12個(gè)雜交組合收獲時(shí)的蓇葖果發(fā)育狀態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)形成飽滿種子的蓇葖果中，雖然不同雜交組合飽滿種子與不飽滿種子數(shù)量存在差異，但所有種子外種皮均變?yōu)楹稚?，且蓇葖果內(nèi)未見黏液存在（圖3）。

未形成種子的則主要有兩種類型：多數(shù)敗育組合的蓇葖果心皮膨大，正常發(fā)育，但蓇葖果內(nèi)胚珠未發(fā)育，并且在收獲時(shí)蓇葖果心皮內(nèi)仍有未干黏液存在（圖4A），可能是胚珠未受精成功;還有一些蓇葖果內(nèi)有少數(shù)胚珠發(fā)育膨大，但是未發(fā)育形成飽滿種子，雖外種皮變?yōu)楹稚欠N皮凹陷皺縮，干扁，剝開后發(fā)現(xiàn)內(nèi)空，明顯敗育，蓇葖果心皮內(nèi)未見黏液（圖4B）。

3 討論與結(jié)論

盡管我國是芍藥屬植物的主要原產(chǎn)地[9，10]，但國外對(duì)于芍藥新品種的培育卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于我國，其重要原因之一就在于雜交育種時(shí)設(shè)計(jì)親本組合的廣泛程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我國[11]。本研究通過對(duì)12個(gè)芍藥與牡丹雜交組合結(jié)實(shí)性的調(diào)查分析，篩選出4個(gè)結(jié)實(shí)性較高的遠(yuǎn)緣雜交組合，為進(jìn)一步開展芍藥屬植物雜交育種實(shí)踐提供了種質(zhì)材料。

前人在選擇芍藥母本時(shí)常用單瓣型的‘粉玉奴[12，13]，郝青等發(fā)現(xiàn)并鑒定的我國第一例伊藤雜種‘和諧就是以‘粉玉奴為母本材料培育出的[14]。但‘粉玉奴自然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率較低[7]。本試驗(yàn)選用的4個(gè)芍藥品種在自然授粉情況下結(jié)實(shí)率相對(duì)較高（19～41粒/果），但在與牡丹進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)，即使父本相同，[JP2]其結(jié)實(shí)情況也明顯不同，例如在以‘層中笑為父本的雜交組合中，根據(jù)獲得飽滿種子的數(shù)量，其排序依次為‘矮粉1號(hào)ב層中笑（18）>‘紫鳳羽ב層中笑（12）>‘迷你ב層中笑（1）>‘鳳凰涅槃ב層中笑（0）。[JP]‘鳳凰涅槃在自然授粉結(jié)實(shí)情況下的所有結(jié)實(shí)特性指標(biāo)均高于其他3個(gè)芍藥品種，但與3個(gè)牡丹品種的雜交組合中，授粉75朵花，卻只收獲到1粒成熟飽滿種子。通過對(duì)‘鳳凰涅槃開花進(jìn)程的觀察，發(fā)現(xiàn)其存在花粉早熟現(xiàn)象，即花苞尚未開放前，花粉已經(jīng)成熟散粉，并且花柱頭分泌黏液也較早，花朵開放2～3天即大量分泌黏液，說明‘鳳凰涅槃存在雌雄蕊雙重早熟的特性，這些因素可能導(dǎo)致了其人工雜交不親和、結(jié)實(shí)率低。

父本花型和花粉活力是雜交親和性和結(jié)實(shí)率的重要影響因素，選擇花粉活力較高的父本能顯著提高結(jié)實(shí)率[15，16]。本研究的3個(gè)父本牡丹品種分屬于中原牡丹品種群、日本牡丹品種群和紫斑牡丹品種群，花粉活力均大于60%，分別為8843%（‘層中笑）、8848%（‘花王）、65.57%（‘月宮燭光），但與芍藥雜交后的結(jié)實(shí)率并不呈正相關(guān)。例如，以‘紫鳳羽為母本的雜交組合中，按照結(jié)實(shí)率由高到低的順序，其父本依次是‘月宮燭光、‘層中笑、‘花王。這種不一致性充分表明，在父本花粉活力超過60%的前提下，雜交組合的結(jié)實(shí)率高低與父本花粉活力沒有必然關(guān)聯(lián)。

芍藥與牡丹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[17]，雜交時(shí)往往存在雜交障礙，可能是受精前障礙，也可能是受精后障礙，或者二者兼而有之，均影響其結(jié)實(shí)性[18，19]。為判斷雜交障礙類型，以往研究往往采用熒光顯微觀測(cè)法或石蠟切片法，前者授粉后72小時(shí)內(nèi)定期取樣，后者則在授粉后到種子成熟期間定期取樣[7]，不僅繁瑣，而且浪費(fèi)了大量寶貴的雜交組合材料。本研究在種子成熟時(shí)取樣觀測(cè)，并結(jié)合結(jié)實(shí)特性數(shù)據(jù)，可基本判定不同雜交組合的主要不親和類型，例如圖4所示的3個(gè)雜交組合中，‘矮粉1號(hào)ב花王和‘鳳凰涅槃ב花王組合均屬于受精前障礙，而‘鳳凰涅槃ב層中笑則屬于雙重障礙。針對(duì)不同原因造成的雜交結(jié)實(shí)特性弱的問題，今后在開展相關(guān)雜交時(shí)可以有意識(shí)地采用相應(yīng)措施予以預(yù)防，如針對(duì)受精后障礙，可采取幼胚拯救培養(yǎng)法，而針對(duì)受精前障礙，則可嘗試柱頭切割、花粉蒙導(dǎo)等方法。

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