一種微量樣品快速測定比色法在水環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用研究

王文靜 趙旭 甄航勇 錢寶

摘要：分光光度法在我國水環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但在分析批量樣品時需投入大量人力物力，成本較高。利用酶標儀微量比色法，提出了一種對微量、批量樣品的快速測定方法。以水中氨氮檢測為例，確定了該方法的最佳參數(shù)和條件，并與傳統(tǒng)的分光光度法進行比較。酶標儀微量比色法與分光光度法在線性范圍、檢出限、最低檢出限、靈敏度等分析參數(shù)上沒有明顯差異。通過對實驗條件的優(yōu)化，酶標儀微量比色法測定氨氮僅需樣品體積200 μL，納氏試劑4μL，1 min內(nèi)可以完成96個樣品的測定，彌補了分光光度法在批量操作上的不足，減少了實驗廢水的排放，使分析檢測工作快速、準確和省時。

關(guān)鍵詞：酶標儀微量比色法;分光光度法;微量測定;氨氮檢測;水環(huán)境監(jiān)測

中圖法分類號：X832

文獻標志碼：A

DOI： 10.15974/j.cnki.slsdkb.2020.05.012

1 研究背景

分光光度法是一種歷史悠久的經(jīng)典水環(huán)境監(jiān)測方法，因其設(shè)備簡單、操作方便，且具有較好的靈敏度和選擇性，在水質(zhì)檢測中應(yīng)用較為廣泛。分光光度法也是國標中常見的推薦方法之一，如納氏試劑分光光度法測定氨氮、二苯碳酰二肼分光光度法測定六價鉻、鉬酸銨分光光度法測定總磷等。然而，在批量樣品分析時，分光光度法需投人大量的人力物力。因此，開展分析試劑減量研究、提高批量操作效率，是實現(xiàn)快速、準確、省時和綠色分析檢測工作的需要[1]。

酶標儀是測定酶聯(lián)免疫反應(yīng)的一般儀器，其原理與分光光度法類似，能夠進行微量檢測和批量操作，極大地節(jié)省時間且操作方法簡便，檢測成本低廉[2]。酶標儀主要應(yīng)用于生物醫(yī)藥檢測方面[3]，在水質(zhì)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用報道較少。范鵬等[4]分別用紫外分光光度計與酶標儀測定鹽酸川穹嗪的含量，結(jié)果顯示兩種方法對鹽酸川穹嗪的測定結(jié)果沒有顯著差異。蘇敏等[5]建立了酶標儀測定飲用水中鋁的分析方法，能用于生活飲用水等常規(guī)水質(zhì)分析中鋁的測定。楊帆等[6]分別采用分光光度法和酶標儀微量法測量發(fā)酵菌液濃度，結(jié)果表明兩種方法測量的結(jié)果無顯著性差異（t=0.02）。

本研究以水質(zhì)檢測中常見的納氏試劑分光光度法（ HJ 535-2009）為例，將酶標儀推廣用于分光光度法，提出一種對微量、批量樣品的優(yōu)化測定方法，實現(xiàn)對水中氨氮的快速檢測。通過考察樣品體積、顯色時間、顯色方式等對微量測定的影響，比較了酶標儀微量比色法與分光光度法測定結(jié)果的差異，在此基礎(chǔ)上分析得到環(huán)境水樣的氨氮濃度。該方法試劑用量少、可以實現(xiàn)快速批量測定，以較低的成本來彌補分光光度法在批量測定上的不足，以期為水中氨氮檢測提供更好的方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

實驗儀器包括：K3型酶標儀（LabServ，USA），為8通道垂直光路光密度檢測儀，測量波長范圍為基金項目：湖北省自然科學(xué)基金資助項目（2017CFB312）400 - 750 nm;可見分光光度計（T6新悅，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），光學(xué)系統(tǒng)為雙光束比例監(jiān)測，測量波長范圍為325 -1 100 nm;96孔微孔板（Thermo，USA）。

實驗試劑包括：氨氮標準使用液（10mg/L）;酒石酸鉀鈉溶液（500 g/L）;Hgl：-KI-NaOH溶液（HJ535-2009）。所用試劑均為分析純，實驗用水為三級純水。

2.2 樣品來源

標準樣品采用有證標準物質(zhì)配制。氨氮環(huán)境水樣選取漢江（襄陽余家湖）和唐白河（襄陽唐白河口）2條污染情況不同的河流，樣品編號為S1、S2。

2.3 標準系列制備

分光光度法分別移取0.00，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00 mL和10.00 mL氨氮標準使用液于50 mL具塞刻度管中，加水至50 mL，按照標準方法進行測定。酶標儀微量比色法對應(yīng)取0，2，4，8，16，24，32 μL和40 μL氨氮標準使用液于96孔微孔板中，加水至200μL，對應(yīng)的氨氮含量與分光光度法一致。繪制不同樣品體積的標準曲線時，對應(yīng)按比例移取氨氮標準使用液。

2.4 實驗方法

納氏試劑分光光度法測定采用標準方法（HJ535-2009）。加入1.0 mL 500 g/L酒石酸鉀鈉溶液搖勻，再加入納氏試劑1.0 mL搖勻。室溫下放置10 min后，使用光程為20 mm比色皿，在420 nm波長下以水做參比，測定吸光度。酶標儀微量比色法對應(yīng)加入4μL酒石酸鉀鈉溶液、4μL納氏試劑，在優(yōu)化條件下顯色后，于420 nm波長處測定光密度（OD）值。繪制不同樣品體積的標準曲線時，對應(yīng)按比例移取酒石酸鉀鈉溶液和納氏試劑。酶標儀微量比色法實驗中所用溶液均為配置后使用移液槍移取。

2.5 數(shù)據(jù)處理

進行樣品測定前，以空氣為參比，對96孔微孔板進行測定，連續(xù)兩次測定的差值應(yīng)小于0.002。測定樣品時，每個板保留一個空白樣，每批樣品連續(xù)測定兩次取平均值，扣除空白后參與濃度計算。

使用線性范圍、檢出限、最低檢測限、精密度和靈敏度分析參數(shù)優(yōu)化后的結(jié)果;線性范圍是通過測定標準溶液的最低和最高濃度來確定;檢出限為3倍空白水樣的標準偏差;最低檢測限為檢出限的4倍;精密度用相對標準偏差表示;靈敏度用校準曲線的斜率表示[7-8];準確度用加標回收率來表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗參數(shù)優(yōu)化

樣品體積、顯色方式、顯色時間等是影響酶標儀微量測定的重要參數(shù)，實驗對其逐一進行優(yōu)化。納氏試劑分光光度法測定氨氮顯色的最佳溫度為20C-25℃[9-10]，本研究在室溫下操作，不再進行顯色溫度的優(yōu)化。

3.1.1 樣品體積

酶標儀的光源從微孔板底部透射，加樣量應(yīng)滿鋪微孔底部，同時不能溢出微孔[11]。用Therm0 96孔微孔板工作體積為50-250 μL，設(shè)置50，100，150，200μL和250 μL這5個樣品體積梯度。圖1為相同濃度氨氮標準序列樣品在不同樣品體積梯度下的標準曲線。不同體積樣品繪制的曲線相關(guān)系數(shù)均可達到0.995以上。隨著樣品量的增加，同一濃度樣品的光密度逐漸增大，標準曲線斜率也逐漸增大。標準曲線斜率對標準樣品的檢測值計算有比較明顯的影響[12]。

對已知濃度為0.540+0.027 mg/L的氨氮標準樣品（BW085515 160957）進行測定，測定結(jié)果見表1。對于氨氮樣品，當樣品體積為50 μL時，測定結(jié)果不準確;當樣品體積為100 μL時，測定結(jié)果合格，但與標準值相對誤差較大;當樣品體積達到150 μL及以上時，測定結(jié)果較好。綜合考慮靈敏度、準確度以及操作的便捷性，氨氮樣品體積取200 μL為宜。

3.1.2 顯色方式

納氏試劑分光光度法測定氨氮，搖勻后靜置10mm即可進行測定。由于96孔微孔板反應(yīng)室體積小，酶標儀微量比色法溶液組分之間不易交換，借助振蕩等手段可以消除氣泡，快速將溶液搖勻[11-13]。通過對比振蕩10 s后靜置顯色和保持振蕩顯色可以看出（見圖2），兩者顯色完成度基本一致，但靜置顯色的測定結(jié)果的平行性明顯較差，這可能是靜置條件容易造成顯色不均勻。

3.1.3 顯色時間

納氏試劑分光光度法在10 -30 min顯色較穩(wěn)定，40 min以后逐漸褪色，光密度值逐漸降低[14-15]。圖3為不同時間條件下酶標儀微量比色法的標準曲線斜率。隨著振蕩時間的增加，同一濃度溶液顯色后的光密度值呈逐漸增大趨勢，曲線斜率呈上升的趨勢。對于氨氮測定來說，在10 min后光密度值基本達到穩(wěn)定且線性較好，說明10 min顯色基本完成。

與傳分光光度法顯色時間相比，酶標儀微量比色法顯色在時間上沒有明顯優(yōu)勢，但酶標儀可以在1 min內(nèi)同時測定96個樣品，減少了繁瑣更換和清洗比色皿等工作[16]，且提高了測定效率，節(jié)約了分析時間。

3.2 與分光光度法的對比

3.2.1 線性及靈敏度比對

本研究采用的酶標儀微量比色法與傳統(tǒng)的分光光度法相比，一次性分析樣品數(shù)量為96個，所需樣品體積不超過250 μL。每個樣品氨氮測定消耗納氏試劑體積僅為4 μL。微量比色法可以大幅度提高分析效率，節(jié)約試劑成本。在優(yōu)化實驗條件下，用酶標儀微量測定法重復(fù)空白實驗9次，計算檢出限。兩種方法的參數(shù)比對見表2。酶標儀在批量分析微量體積樣品時優(yōu)勢明顯，且線性范圍、檢出限、最低檢出限、靈敏度等分析參數(shù)沒有明顯差異。酶標儀微量比色法測定水中氨氮的方法經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化后，可以滿足分析試劑減量、提高批量操作效率的需求。

3.2.2 環(huán)境水樣及準確度比對

分別用酶標儀微量比色法和分光光度法對采取的環(huán)境水樣進行測定，每組水樣取7個平行樣進行測定，測定結(jié)果見表3。取10 μL濃度為10 mg/L的氨氮標準溶液加入水中，計算加標回收率。酶標儀微量比色法和分光光度法測定環(huán)境水樣的結(jié)果一致性較好，酶標儀微量比色法測定的加標回收率符合要求。

4 結(jié)語

本文采用酶標儀微量比色法測定氨氮，標準曲線分別移取0，2，4，8，16，24，32μL和40μL氨氮標準使用液于96孔微孔板中，加水至200 μL;環(huán)境水樣取200 μL樣品于96孔微孔板中。依次加入4μL酒石酸鉀鈉溶液、4μL納氏試劑，室溫下振蕩顯色10min，于420 nm波長處用酶標儀測定光密度，減去空白值后，根據(jù)標準曲線換算成樣品濃度。

采用酶標儀微量比色法測定水中氨氮，其線性范圍、檢出限、最低檢出限、靈敏度等分析參數(shù)與納氏試劑分光光度法沒有明顯差異。酶標儀在批量分析微量體積樣品時優(yōu)勢明顯。

酶標儀微量比色法在分析大批量樣品時具有明顯優(yōu)勢，可滿足分析檢測工作的需要，同時可明顯減少分析試劑尤其是有毒實驗廢液的排放，有效減輕二次污染。此外，本研究方法可以拓展到其他比色法測定項目，為水質(zhì)檢測提供新的技術(shù)方法。

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（編輯：李慧）

作者簡介：王文靜，女，工程師，主要從事水環(huán)境監(jiān)測工作。E-mail： sofie2008@sina.com