分子標(biāo)記輔助選擇改良‘黃華占’的褐飛虱抗性與抗旱性

王飛名，孔德艷，劉國(guó)蘭，劉 毅，余新橋,2，畢俊國(guó)，羅利軍，張安寧*

(1上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心,上海201106；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站,上海201415)

稻褐飛虱(Brown planthopper，BPH)是世界稻區(qū)主要水稻害蟲之一，為單食性害蟲，僅以水稻和普通野生稻為食及繁殖后代。褐飛虱是一種典型的刺吸式害蟲，靠吸食水稻韌皮部汁液為生，為害較輕時(shí)導(dǎo)致水稻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受阻，影響千粒重[1]；嚴(yán)重時(shí)造成水稻減產(chǎn)，甚至絕收[2]。目前，防控褐飛虱主要還是依賴于化學(xué)方法防治，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且對(duì)環(huán)境有害。生產(chǎn)實(shí)踐表明，選育褐飛虱抗性水稻品種是控制褐飛虱危害的資源節(jié)約與環(huán)境友好的方法[3]。

分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)能夠快速而精確地選擇目標(biāo)基因，是一種導(dǎo)入有利基因進(jìn)行遺傳改良的有效方法[4]。Bph14和Bph15 是水稻中2個(gè)主效抗褐飛虱基因，分別定位于第3和第4染色體上,分別解釋24%和16%的遺傳變異[5]。李進(jìn)波等[6]將來(lái)源于水稻品系B5 的抗性基因Bph15導(dǎo)入到‘93-11’等秈稻品種中，發(fā)現(xiàn)含有抗性基因的材料抗性較高，表明Bph15基因可以達(dá)到增強(qiáng)水稻褐飛虱抗性的目的。

我國(guó)稻田中65%以上為中低產(chǎn)田，其中干旱是最主要的產(chǎn)量限制因子之一。由于雨量在季節(jié)上分布不平衡,旱災(zāi)在長(zhǎng)江流域、華南等稻區(qū)的發(fā)生較為頻繁，一旦發(fā)生干旱，水稻將大幅減產(chǎn)。 培育和推廣節(jié)水抗旱稻新品種,對(duì)于穩(wěn)定和提高中低產(chǎn)田的產(chǎn)量水平具有重要意義。節(jié)水抗旱稻是指既具有水稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特性、又具有旱稻的節(jié)水抗旱特性的一種新的水稻品種類型(農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2862—2015)。在灌溉條件下，節(jié)水抗旱稻的產(chǎn)量、米質(zhì)與普通水稻基本持平，但可節(jié)水50%以上；在望天田，其具有較好的抵抗干旱能力(或基本具有旱稻品種的抗旱能力)；在栽培上，簡(jiǎn)單易行，投入低，節(jié)能環(huán)保[7]。筆者所在團(tuán)隊(duì)通過(guò)水稻與旱稻資源的雜交，培育出了全球首例節(jié)水抗旱稻三系不育系滬旱1A[8]，并實(shí)現(xiàn)節(jié)水抗旱雜交稻三系配套；通過(guò)常規(guī)育種手段已培育出一批節(jié)水抗旱稻新品種并應(yīng)用于生產(chǎn)，表現(xiàn)出明顯的節(jié)水抗旱特性，目前已有‘滬旱15’‘旱優(yōu)73’‘旱優(yōu)113’和‘旱優(yōu)3號(hào)’等多個(gè)品種通過(guò)審定，并且在安徽、湖北、廣西等地大面積推廣應(yīng)用[9-11]。

作物抗旱性狀比較復(fù)雜，涉及大量功能基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，單個(gè)基因的轉(zhuǎn)移通常難以獲得理想的效果。 常規(guī)育種往往利用抗旱性強(qiáng)的旱稻資源材料與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種雜交，在嚴(yán)格的水分脅迫條件下對(duì)分離世代的材料進(jìn)行篩選，這種自然的選擇壓促使了抗旱相關(guān)基因的聚合[7]。

‘黃華占’是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所培育的優(yōu)良常規(guī)稻品種，先后通過(guò)廣東、湖北、湖南、海南、廣西、浙江、重慶、陜西等省(市)審定。該品種生育期適中，抗倒性強(qiáng)，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，米質(zhì)優(yōu)[12]，適合直播，深受種植大戶喜愛(ài)。以‘黃華占’為親本，衍生了多個(gè)品種通過(guò)審定[13]。但筆者多年鑒定發(fā)現(xiàn)，其抗旱性與褐飛虱抗性較差。本研究擬以抗旱性好且攜帶褐飛虱抗性基因Bph15的節(jié)水抗旱稻材料M535(其系譜為：‘滬旱15’//滬旱1B/B5)為供體材料，以‘黃華占’為受體材料，通過(guò)雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇，并進(jìn)行嚴(yán)格的水分脅迫篩選，將Bph15基因與抗旱性導(dǎo)入到‘黃華占’背景中，旨在培育具有褐飛虱抗性與抗旱性的新品系。

1 材料與方法

1.1 抗性株系的選育方法

于2012—2016年進(jìn)行選育，所有田間試驗(yàn)材料種植在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站以及海南陵水試驗(yàn)基地，分子標(biāo)記檢測(cè)在上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。以M535為供體親本，以‘黃華占’為受體親本，雜交后回交一次。對(duì)種植的30個(gè)BC1F1單株使用與Bph15連鎖的分子標(biāo)記Ms5進(jìn)行目標(biāo)基因檢測(cè)，篩選出16株Bph15基因雜合單株，然后繼續(xù)與‘黃華占’回交，得到BC2F1的種子，在30株BC2F1中取葉片進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，檢測(cè)出含有Bph15基因的雜合單株17株，選擇與‘黃華占’田間農(nóng)藝性狀相似的6個(gè)單株?；焓?個(gè)單株，種植2 000株于旱地進(jìn)行抗旱性初篩，分子標(biāo)記檢測(cè)選擇Bph15基因的純合單株并進(jìn)行表型鑒定選擇，獲得表型與‘黃華占’相似的12個(gè)單株?；焓?2個(gè)單株并種植200株BC2F3于旱地進(jìn)行抗旱性復(fù)篩，此后再進(jìn)行兩輪抗旱性復(fù)篩，篩選出3株抗旱性明顯提高，含有Bph15純合基因，且表型與‘黃華占’相似的單株(BC2F5)，用于后續(xù)研究(圖1)。

分子標(biāo)記Ms5的引物正反序列分別為5’-TTGTGGGTCCCATCTCCTC-3’、5’-TGACAACTTGTGCAA-GATCAAA-3’[6]。采集水稻材料幼嫩葉片，用CTAB法快速提取DNA，PCR擴(kuò)增體系參照樓巧君等[14]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳，經(jīng)銀染法顯帶后檢測(cè)。

1.2 遺傳背景分析

2017年7月采集3個(gè)改良株系以及供體親本M535、受體親本‘黃華占’的葉片，委托華智水稻生物技術(shù)有限公司，利用56K水稻全基因組SNP芯片檢測(cè)基因組差異，并計(jì)算遺傳背景回復(fù)率[15]。

1.3 褐飛虱苗期鑒定方法

分別于2015年與2016年6—9月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定。采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)苗期群體篩選法(SSST法)進(jìn)行[16]，水稻浸種催芽后播種在鑒定圃水泥池內(nèi)，每份材料設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20株左右，播種4 d后定苗，每重復(fù)保留秧苗15株，在秧苗2—3葉期時(shí)按照每株褐飛虱2—3齡若蟲5—7頭的量進(jìn)行接蟲。苗期抗性評(píng)價(jià)參照IRRI[17]與陶林勇等[18]的方法進(jìn)行。當(dāng)感蟲對(duì)照品種‘TN1’死苗率達(dá)到95%左右時(shí)按照表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查。

表1 水稻苗期褐飛虱抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 抗旱性及主要農(nóng)藝性狀考察

試驗(yàn)于2016年5—10月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)站的抗旱鑒定試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行；試驗(yàn)地前茬為大麥，土壤質(zhì)地為壤土，土地較肥沃且地力均勻。

試驗(yàn)材料為3個(gè)改良株系以及輪回親本‘黃華占’，抗旱對(duì)照品種為‘滬旱3號(hào)’。

參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 2863—2015節(jié)水抗旱稻抗旱性鑒定技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行抗旱性鑒定。將試驗(yàn)材料分別種植于抗旱鑒定島(旱地)與抗旱鑒定島旁邊的水田，旱地與水田均采取直播方式種植，5月25日播種，穴播株行距為20cm×20cm，每穴點(diǎn)播3粒種子，小區(qū)大小為10穴/行×12行；6月10日間苗一次，密度為1株/穴。記載生育期，成熟期時(shí)兩種處理各取第3行的第3、4、5穴進(jìn)行考種，水田考察株高、穗長(zhǎng)、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株重，旱地考察單株重，計(jì)算抗旱指數(shù)。各小區(qū)實(shí)收并折算成標(biāo)準(zhǔn)含水量下的單產(chǎn)。

數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計(jì)分析分別利用Excel 2007及SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAS與抗旱性篩選及目標(biāo)株系的獲得

2012年在上海配制F1雜交種，以后每年分別在海南與上海進(jìn)行回交與自交。圖2A為2014年在上海用分子標(biāo)記Ms5篩選BC2F2代群體單株分子檢測(cè)的部分結(jié)果，可以看出：分子標(biāo)記Ms5在兩個(gè)親本P1與P2間表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，雜合單株同時(shí)含有父本(M535)、母本(‘黃華占’)雙親的雙條帶，陽(yáng)性純合單株只有與M535相同的單條帶，陰性純合單株只有與‘黃華占’相同的單條帶。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和田間農(nóng)藝性狀觀察，獲得了導(dǎo)入純合Bph15基因且田間農(nóng)藝性狀與受體‘黃華占’相似的3個(gè)單株，編號(hào)分別為W1、W2、W3。2015年在上海種植BC2F4代株系并進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，每個(gè)株系檢測(cè)13株。從圖2B可知，所有的單株與供體親本M535的帶型相同，表明獲得的目標(biāo)株系均導(dǎo)入了純合的Bph15基因。

2.2 改良株系的遺傳背景分析

利用56K水稻全基因組SNP 芯片分析了3個(gè)改良株系的遺傳背景。從56 000個(gè)SNP中挑選33 782個(gè)SNP分析受體親本‘黃華占’與供體親本M535的基因型差異，結(jié)果表明：兩個(gè)親本有差異的SNP總數(shù)為13 543個(gè)。3個(gè)改良株系W1、W2、W3的背景回復(fù)率分別為92.01%、88.18%和84.26%(圖3)。

2.3 改良株系的苗期褐飛虱抗性鑒定

2015—2016年在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，以受體親本‘黃華占’、供體親本M535、感蟲品種‘TN1’為對(duì)照，對(duì)3個(gè)株系W1、W2、W3進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定。鑒定結(jié)果表明，對(duì)照品種‘TN1’兩年中均表現(xiàn)高感，而供體親本M535在兩年均表現(xiàn)抗蟲(表2)。3個(gè)株系W1、W2和W3也表現(xiàn)抗褐飛虱(3級(jí))。受體親本‘黃華占’兩年的抗性級(jí)別分別為高感(2015年)與感蟲(2016年)。

表2 目標(biāo)改良株系對(duì)褐飛虱苗期抗性鑒定結(jié)果

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，下同

2.4 改良株系的產(chǎn)量、主要農(nóng)藝性狀及抗旱性表現(xiàn)

在正常水分栽培管理下，3個(gè)改良株系的生育期與‘黃華占’一致，均為125 d。實(shí)測(cè)產(chǎn)量及8個(gè)主要農(nóng)藝性狀的比較分析結(jié)果(表3)表明，3個(gè)株系的產(chǎn)量、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率等與‘黃華占’均沒(méi)有顯著差異。株系W2的穗長(zhǎng)比‘黃華占’顯著增長(zhǎng)，其他2個(gè)株系的穗長(zhǎng)與‘黃華占’無(wú)顯著差異。株系W3的千粒重比‘黃華占’重，達(dá)到極顯著水平，其他2個(gè)株系與‘黃華占’無(wú)顯著差異。3個(gè)株系的株高均與‘黃華占’有極顯著差異，且3個(gè)株系之間也有顯著差異。

表3 目標(biāo)改良株系與‘黃華占’的主要農(nóng)藝性狀比較

注：不同大小寫字母分別表示同列數(shù)據(jù)在0.01或0.05水平上差異顯著

抗旱鑒定結(jié)果(表4)表明，3個(gè)株系的旱地單株產(chǎn)量均比‘黃華占’高。3個(gè)株系的抗旱性級(jí)別均達(dá)到3級(jí)以上，其中W1、W3抗旱性級(jí)別達(dá)到2級(jí)，而‘黃華占’的抗旱性級(jí)別為4級(jí)。

表4 目標(biāo)改良株系與‘黃華占’的抗旱性比較

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種方法，將褐飛虱抗性基因Bph15導(dǎo)入到優(yōu)良常規(guī)稻‘黃華占’中，并通過(guò)抗旱性篩選與鑒定，獲得3個(gè)既抗褐飛虱又抗旱且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品系，為節(jié)水抗旱稻育種提供了重要的中間材料。基于MAS方法改良水稻抗病、抗蟲性狀已有一些成功的例子，但分子標(biāo)記輔助選擇在提高水稻的抗旱性上，特別是褐飛虱抗性與抗旱性聚合后的基因效應(yīng)及其在水稻育種上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

傳統(tǒng)的水稻抗褐飛虱育種，主要是利用抗褐飛虱品種與改良親本進(jìn)行雜交，在分離世代進(jìn)行多次褐飛虱抗性篩選，以期選育抗褐飛虱品種。但是褐飛虱鑒定需要人工養(yǎng)殖足夠的蟲源，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且鑒定的結(jié)果受環(huán)境的影響較大，可能會(huì)入選抗性不好的假陽(yáng)性單株。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)不受這些限制，利用分子標(biāo)記在低世代中鑒定導(dǎo)入純合褐飛虱抗性基因的單株，提高了育種效率和準(zhǔn)確性。本研究通過(guò)1次雜交和2次回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和田間表型篩選，選育出抗性與供體親本一致的3個(gè)株系，僅用4年時(shí)間，明顯提高了改良的效率。利用水稻育種芯片分析了3個(gè)改良株系的遺傳背景，3個(gè)改良株系的背景回復(fù)率均高于80%，說(shuō)明連續(xù)表型鑒定對(duì)于選擇高背景回復(fù)率具有明顯的效果。本研究選育出的3個(gè)株系，其褐飛虱抗性水平與供體M535一致，且鑒定結(jié)果連續(xù)兩年穩(wěn)定一致，可以確定W1、W2、W3可作為優(yōu)良的褐飛虱抗性資源。但是，本研究選育的3個(gè)株系其褐飛虱抗性均未達(dá)到高抗及以上的程度，這可能是因?yàn)橹粚?dǎo)入了1個(gè)抗性基因Bph15。李進(jìn)波等[3]研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入2個(gè)抗性基因的材料比含有單個(gè)抗性基因以及沒(méi)有抗性基因的材料抗性高，表明基因聚合可以達(dá)到增強(qiáng)水稻褐飛虱抗性的目的。接下來(lái)的研究將在選育的株系中繼續(xù)導(dǎo)入其他褐飛虱抗性基因，進(jìn)一步提高其抗性水平。

本研究所用的供體親本M535，其系譜來(lái)源為‘滬旱15’//滬旱1B/B5，其遺傳組成上除了褐飛虱抗性材料B5，還有節(jié)水抗旱稻品種(系)‘滬旱15’與滬旱1B。本研究通過(guò)雜交技術(shù)，將‘滬旱15’與滬旱1B的抗旱相關(guān)基因?qū)胼喕赜H本中，通過(guò)4輪嚴(yán)格的水分脅迫篩選，促使了抗旱相關(guān)基因的聚合并進(jìn)行抗旱性表達(dá)[7]，取得顯著的效果。本研究選育的3個(gè)株系，其抗旱性明顯優(yōu)于輪回親本‘黃華占’，W1、W3的抗旱級(jí)別甚至達(dá)到2級(jí)，與抗旱對(duì)照品種‘滬旱3號(hào)’抗旱性一致，可以認(rèn)為W1、W2、W3可作為優(yōu)良的抗旱性資源。

本研究表明，3個(gè)改良株系與‘黃華占’在產(chǎn)量、生育期上基本一致，除了株高增高外，其他主要農(nóng)藝性狀也基本一致。因此，可以認(rèn)為3個(gè)株系W1、W2、W3可以作為‘黃華占’的抗旱性、褐飛虱抗性改良系。但本試驗(yàn)沒(méi)有涉及到3個(gè)改良株系的稻米品質(zhì)表現(xiàn)以及生態(tài)適應(yīng)性表現(xiàn)，尚需進(jìn)一步研究。