丁香玉，趙漫，王鵬偉，丁新華，儲昭輝，趙翔宇，李洋 ,

1 作物生物學(xué)國家重點實驗室/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，泰安市岱宗大街61號 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安市岱宗大街61號 271018

羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是一類?；?輔酶A-依賴的?；D(zhuǎn)移酶，具有?；荏w的特異性，是催化一咖啡?？崴嶙詈笠徊缴锖铣傻年P(guān)鍵酶，催化咖啡酰輔酶 A和奎尼酸進行酯交換生成一咖啡?？崴醄1]。

一咖啡?？崴崾窃S多植物中重要的苯丙酸，包括煙草，番茄，馬鈴薯,蘋果等[2-4]。根據(jù)咖啡?；诳崴嵘系慕Y(jié)合部位不同，一咖啡酰奎尼酸可分為多種異構(gòu)體：1-咖啡?？崴幔?-CQA）、3-咖啡?？崴幔?-CQA）、4-咖啡?？崴幔?-CQA）和5-咖啡?？崴幔?-CQA，CGA，綠原酸）。1-CQA 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是 NF-?B 途徑的潛在抑制因子，具有抗癌能力。3-CQA 在人類膳食中普遍存在，可以有效的預(yù)防肝臟系統(tǒng)疾病、高血壓血脂癥、肥胖等疾病[5-6]。4-CQA則具有非常強的消炎作用[7]。5-CQA 是其中最主要的一種同分異構(gòu)體，在人體健康中發(fā)揮重要作用，能夠減緩葡萄糖向血液中的釋放，具有預(yù)防、降低心臟病和Ⅱ型糖尿病風(fēng)險的作用[8-10]。綠原酸還是重要的天然抗氧化劑，能夠幫助植物細胞抵御低溫、紫外線等各種非生物脅迫以及病原，害蟲侵害等生物脅迫[11]。目前在煙草葉片中只檢測出3-CQA，4-CQA 和5-CQA 三種一咖啡?？崴醄12]。

黃酮醇作為重要的苯丙烷類物質(zhì)，廣泛存在于多種茄科作物中，包括煙草，番茄，馬鈴薯等[13]。在煙草中主要是蘆丁和山奈酚蕓香糖苷，但含量極少，在人體中具有強抗氧化、清除人體自由基和抗菌消炎等多種作用[14]。對植物自身而言，黃酮醇類物質(zhì)能夠增強植物抗性，幫助植物抵抗各種生物和非生物脅迫，如病蟲侵害和環(huán)境逆境等[15-17]。本文旨在分析HQT 基因?qū)煵荽紊x物質(zhì)的影響，獲得富含一咖啡酰奎尼酸的轉(zhuǎn)基因煙草，并探究HQT 基因?qū)S酮醇生物合成的影響，對煙草次生代謝機制進行初步研究，為培育富含營養(yǎng)物質(zhì)且具有更強抗逆能力的煙草做基礎(chǔ)鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

三生煙（Nicotiana tabacum cv. samsun），植株在25℃，16 h/8 h 光暗周期，相對濕度為（70±10）%的溫室內(nèi)培養(yǎng)。煙草在營養(yǎng)缽中生長至8 葉期，取中部葉片進行檢測。

大腸桿菌Escherichia coli DH5ɑ，農(nóng)桿菌LBA4404和真核表達載體pCXSN 均由本實驗室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 NtHQT 基因克隆和表達載體構(gòu)建

采用TRI Reagent （Sigma，美國）提取三生煙草（Nicotiana tabacum cv. samsun）葉片總RNA，取1 μg 總RNA 用DNaseI（NEB，美國）37℃處理15 min，75℃酶滅活10 min，去除基因組DNA，作為RNA 模板。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，日本），向RNA 模板中加入2 μL 5 × RT Master Mix Ⅱ，RNase-free ddH2O 補充至10 μL，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，98℃酶滅活5 min，獲得cDNA，置于-20℃保存。

以上述反應(yīng)得到的cDNA 為模板，根據(jù)煙草HQT基因序列（GeneBank AJ582651）和EST 序列特征，設(shè)計NtHQT 基因引物，引物序列為NtHQT-F：5’-ATGGGAAGTGAAAAAATGAT-3’ 和NtHQT-R：5’-CAAAATTCATACAAATACTTCT-3’ （華大基因股份有限公司，深圳）。采用LAmp 高保真DNA 聚合酶（康為，北京）進行擴增，反應(yīng)體系為50 μL：50 ng 模板，1 U DNA 聚合酶，5 μL 10×PCR 緩沖液，5 μL dNTPs （2 mmol/L），1 μL 引物（10 μmol/L），3 μL MgSO4，ddH2O 補充至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，35 個循環(huán)：94℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸90 s（30-60 s/kb），擴增產(chǎn)物切膠回收?；厥蘸驨tHQT 基因片段和實驗室保存的表達載體pCXSN，用Xcm I（NEB，美國）分別進行酶切，純化后將載體和目的基因片段用T4 DNA 連接酶（ThermoFisher Scientific，美國）進行連接，形成遺傳轉(zhuǎn)化載體pCXSN::NtHQT。轉(zhuǎn)化載體熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑進行菌落PCR 初篩，挑選陽性克隆過夜擴繁，提取質(zhì)粒送至公司（華大基因股份有限公司，深圳）測序。經(jīng)測序無誤后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

選取煙草葉片作為外植體，采用農(nóng)桿菌（LBA4404）介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法[18]，將已構(gòu)載體pCXSN::NtHQT轉(zhuǎn)化三生煙草受體材料。待生根培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因煙草根系發(fā)育良好時，移栽到土壤中。采用C TA B[19]法提取植株葉片基因組D N A，以3 5 S 啟動子內(nèi)部序列設(shè)計的引物35S-F：5’-ACGCACAATCCCACTATCCTT-3’和基因內(nèi)部序列設(shè)計的引物N t H Q T - R ：5’-TCAAAATTCATACAAATACTTCT-3’進行PCR陽性檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增出1438 bp片段，為陽性植株。

1.2.3 一咖啡?？崴岷忘S酮醇物質(zhì)提取和HPLC 含量測定

取轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片用液氮研磨至粉末狀，各取0.3 g，3 mL 100%色譜級甲醇-20℃萃取2 h，每15 min 振蕩1 次。4℃、4000 r/min 離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm 有機相微孔濾膜過濾至樣品瓶，取10 μL 過濾液用于HPLC 檢測分析[20-21]，標(biāo)準品為蘆丁，1-咖啡?？崴?，3-咖啡酰奎尼酸，4-咖啡?？崴?，5-咖啡?？崴幔⊿igma），山奈酚蕓香糖苷（Extrasynthese）。野生型和轉(zhuǎn)基因煙草生長至8 葉期，取中部3 片真葉進行檢測。T0代煙草每株檢測重復(fù)3 次；T1代煙草每個株系3 個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 NtHQT 基因克隆和基因表達載體構(gòu)建

按照三生煙草中NtHQT 的已知序列設(shè)計引物，以三生煙草葉片cDNA 為模板，通過PCR 擴增獲得長為1311 bp 的清晰目標(biāo)序列（圖1A），切膠回收后酶切，連接Xcm I 酶切后的pCXSN 載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ，通過35S 啟動子內(nèi)部序列引物35S-F 和基因序列內(nèi)部引物NtHQT-R 對白色克隆進行PCR 陽性驗證（圖1B），擴增出片段長度為1438 bp 的目標(biāo)條帶，選取3 個陽性克隆過夜擴繁后提質(zhì)粒測序。

將測序結(jié)果與目標(biāo)序列NtHQT（GeneBank AJ582651）和pCXSN 載體35S 啟動子進行比對，比對成功，確認成功克隆NtHQT 的完整基因序列，并成功構(gòu)建pCXSN::NtHQT 載體。

圖1 NtHQT 片段擴增電泳及菌落PCR 檢測圖Fig. 1 NtHQT fragment amplification electrophoresis and PCR detection of colony

2.2 NtHQT 基因遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

將構(gòu)建成功的遺傳轉(zhuǎn)化載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌LBA4404，通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入三生煙草中，獲得轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草。通過PCR 對轉(zhuǎn)基因煙草進行陽性檢測（圖2），在獲得的15 株轉(zhuǎn)基因材料中，有11株擴增到了長度為1438 bp 的目標(biāo)條帶，確認為陽性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為73.3%。轉(zhuǎn)基因煙草在表型上與野生型沒有明顯差異（圖3）。

圖2 T0 代 轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草陽性檢測Fig. 2 Positive detection of NtHQT transgenic tobacco in T0 generation

圖3 T1 代三個不同株系轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草表型Fig. 3 Phenotype between three different lines of NtHQT transgenic tobacco in T1 generation and wild-type tobacco

2.3 煙草葉片一咖啡酰奎尼酸和黃酮醇物質(zhì)含量檢測

待煙草葉片生長至8 葉期，參照Luo[21]等HPLC 檢測苯丙烷類物質(zhì)含量的方法，對部分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片進行含量檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)NtHQT 基因的煙草葉片中一咖啡?？崴?、蘆丁、山奈酚蕓香糖苷的含量都有不同程度的提高（圖4，表1）。

圖4 T0 代轉(zhuǎn)基因煙草葉片一咖啡酰奎尼酸及黃酮醇含量HPLC 檢測 Fig. 4 HPLC analysis of CQAs and flavonols contents in NtHQT transgenic tobacco leaves in T0 generation and wild-type

其中，轉(zhuǎn)NtHQT 基因的煙草葉片一咖啡?？崴岬暮刻岣吡?.04～7.28 倍，最高含量達487.00 μg/g (FW)。蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高分別可達208.00 μg/g (FW)和52.00 μg/g (FW)，分別是相同條件下野生型三生煙草葉片中含量的17.83倍和4.3倍。

在T0代陽性植株中隨機選擇3 個株系，編號為NtHQT-1，NtHQT-2 和NtHQT-3，收取種子后進行T1代種植及陽性檢測。每個株系取3 棵生物學(xué)重復(fù)，對陽性植株葉片進行含量測定。轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株三種物質(zhì)含量變化倍數(shù)與T0代基本一致，說明轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草富含一咖啡?？崴峒包S酮醇的優(yōu)勢可以穩(wěn)定遺傳（圖 5，表 2）。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草T0 代葉片中各物質(zhì)含量Tab. 1 Quantification of CQAs and flavonols in NtHQT-expressing tobacco leaves in T0 generation and wild-type (SS)

表2 轉(zhuǎn)基因煙草T1 代葉片中各物質(zhì)含量Tab. 2 Quantification of CQAs and flavonols in NtHQT-expressing tobacco leaves in T1 generation and wild-type (SS)

圖5 T1 代轉(zhuǎn)基因煙草葉片一咖啡?？崴峒包S酮醇含量HPLC 檢測Fig. 5 HPLC analysis CQAs and flavonols contents of NtHQT transgenic tobacco leaves in T1 generation and wide-type

3 結(jié)論與討論

已有文章報導(dǎo)，HQT 基因參與多種植物綠原酸的生物合成。Lepelley M 等通過分析咖啡中HQT 的時空表達模式，發(fā)現(xiàn)其與綠原酸積累和分布的動態(tài)變化有關(guān)[1]。Raja S 在馬鈴薯中通過RNAi 對HQT 的抑制導(dǎo)致綠原酸下降90%以上[22]，結(jié)果均表明NtHQT基因可以正向調(diào)控綠原酸的生物合成。本研究將煙草自身的HQT基因連接35S啟動子構(gòu)建真核表達載體，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)基因煙草，不僅綠原酸含量明顯提高，其他兩種一咖啡?？崴岷恳泊蠓忍岣?。而一咖啡酰奎尼酸不僅能夠幫助植物增強對各種生物及非生物脅迫的抗性[11]，還在人體健康中發(fā)揮重要作用，能夠抗菌消炎，預(yù)防肥胖和心腦血管疾病等[5-6]。一咖啡?？崴崴哂械墓π?，在一定程度上有可能降低吸煙對消費者造成的衰老、心血管疾病等危害。

蘆丁，山奈酚蕓香糖苷均具有較強的抗氧化活性，在人體中具有清除自由基，抵抗衰老的功能；在植物中能夠增強植物對多種病原菌的抗性[23]，幫助植物抵御多種生物與非生物脅迫，但在煙草中含量很少。本實驗獲得的轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草，除檢測到一咖啡?？崴岷孔罡呖商岣?0.34 倍外，蘆丁，山奈酚蕓香糖苷含量也有大幅度提高，暗示黃酮醇合成相關(guān)通路可能被激活。

已有研究表明，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷等黃酮醇物質(zhì)合成與一咖啡?？崴岷铣陕窂焦蚕矶喾N中間酶和前期次生代謝物：以苯丙氨酸為合成底物，經(jīng)過PAL（L-苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸羥化酶）、4CL（p-香豆酰-CoA 合成酶）催化合成p-香豆酸輔酶A。然后以p-香豆酰輔酶A 為底物，通過多種酶分別催化合成一咖啡?？崴?，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷等[21]。結(jié)合實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)HQT 基因煙草葉片中一咖啡?？崴岬暮孔罡呖商岣?0.34 倍，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高可分別提高17.83和16.97倍，推測，煙草HQT 基因的超量表達可能激活一咖啡?？崴岷铣陕窂街猩嫌蜳AL、C4H、4CL 酶以及前期代謝物質(zhì)苯丙氨酸和p-香豆酸輔酶A 的積累，這些合成相關(guān)酶及代謝物質(zhì)的增多，同時促進下游多種黃酮醇合成酶的反應(yīng)，從而更強激活蘆丁和山奈酚蕓香糖苷合成路徑，而這些黃酮醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達變化情況有待進一步研究。

通過對煙草一咖啡?？崴岷铣申P(guān)鍵基因HQT的研究發(fā)現(xiàn)，HQT 基因不僅參與調(diào)控一咖啡?？崴岬暮铣?，也正向調(diào)控?zé)煵葜刑J丁和山奈酚蕓香糖苷的生物合成，有助于了解煙草中次生代謝物質(zhì)，尤其是一咖啡酰奎尼酸及黃酮醇物質(zhì)的合成機理，并為在實際生產(chǎn)中提升煙草品質(zhì)和抗逆能力提供研究基礎(chǔ)。